Кпп ремонт 2109: Ремонт КПП ВАЗ 2109, 2108

Содержание

Ремонт коробки Ваз 2109

Для ремонта КПП Ваз 2109 ее необходимо снять с автомобиля и выполнить следующие действия:

Отверните шесть гаек крепления задней крышки

Отверните болт крепления и снимите кронштейн троса сцепления

Аккуратно сбейте ударами резинового молотка заднюю крышку и снимите ее с картера коробки передач

Снимите уплотнительную прокладку задней крышки КПП Ваз 2109

Включите 3-ю или 4-ю передачу и отверните болт крепления вилки пятой передачи и включите пятую передачу

Убедитесь, что валы не проворачиваются расконтрите гайку на вторичном валу

Отверните гайку на вторичном валу и расконтрите гайку на первичном валу

Отверните гайку на первичном валу и подцепите отвертками за ступицу синхронизатор пятой передачи

Снимите его вместе с вилкой. Выньте вилку из муфты и снимите блокирующее кольцо синхронизатора пятой передачи

Подцепите отверткой ведомую шестерню пятой передачи и снимите ее с вторичного вала

Снимите упорное кольцо игольчатого подшипника и нимите игольчатый подшипник шестерни пятой передачи

Подцепите отверткой ведущую шестерню пятой передачи и снимите ее с первичного вала Ваз 2109

С помощью ударной отвертки отверните четыре винта крепления пластины подшипников и снимите ее

Подцепите отвертками и снимите втулку игольчатого подшипника пятой передачи со вторичного вала, затем снимите упорную шайбу со вторичного вала

Снимите стопорное кольцо подшипника первичного вала. Для этого подожмите одной отверткой стопорное кольцо к кольцу подшипника, а другой отверткой выведите кольцо из канавки. Аналогичным образом снимите стопорное кольцо подшипника вторичного вала

Отверните пробку фиксатора и осторожно извлеките шарик фиксатора с пружиной. Аналогичным образом извлеките еще два фиксатора

Отверните два болта крепления и снимите заднюю опору силового агрегата

Отверните пробку фиксатора заднего хода. Наклоните коробку и извлеките шарик фиксатора с пружиной. Отверните 12 гаек и болт крепления картера коробки передач к картеру сцепления

С помощью большой отвертки аккуратно разъедините картеры сцепления и коробки передач. Между картерами есть три места, куда можно вставить отвертку, чтобы не повредить уплотнительную прокладку. Поочередно вставляйте в эти пазы отвертку и аккуратно покачивайте до тех пор, пока картеры не разъединятся

Снимите картер коробки передач и отверните болт крепления вилки переключения первой и второй передач

Приподнимите шток и снимите его вместе с вилкой переключения первой и второй передач и отверните болт крепления вилки переключения третьей и четвертой передач

Выведите головку штока из зацепления с рычагом и снимите его вместе с вилкой

Поверните шток вилки пятой передачи, выведя его головку из рычага. Выньте шток и снимите стопорное кольцо

Снимите вилку включения заднего хода и шестерню заднего хода с осью

Слегка покачивая, выньте одновременно первичный и вторичный валы. При снятии обоих валов коробки передач внутренние кольца передних подшипников остаются на валах

Выньте ведомую шестерню главной передачи вместе с дифференциалом и Отверните три болта крепления механизма переключения передач Ваз 2109

Снимите механизм переключения передач и аккуратно снимите уплотнительную прокладку

Выпрессуйте передний подшипник вторичного вала из картера сцепления. Для этого можно использовать лапку съемника или аналогичный инструмент. Чтобы заменить передний подшипник первичного вала, выпрессуйте сальник

Выпрессуйте подшипник внутрь картера, прикладывая усилие к наружному кольцу подшипника и выньте магнит из картера сцепления

Отверните гайку крепления корпуса привода спидометра и снимите корпус с ведомой шестерней привода спидометра

Выньте из корпуса ведомую шестерню с валом привода спидометра и вытолкните уплотнительное кольцо из корпуса привода спидометра

Выверните из картера коробки передач выключатель света заднего хода и сдвиньте защитный чехол шарнира тяги привода переключения передач с отбортовки на коробке передач

Снимите противоположную кромку защитного чехла с фланца шарнира и отверните болт крепления шарнира к штоку

Снимите шарнир со штока и защитный чехол

Отверните болт крепления рычага к штоку переключения передач внутри картера сцепления и выньте рычаг и шток из картера сцепления

Если в процессе эксплуатации были замечены следы подтекания масла через отверстие в картере сцепления под шток переключения передач, замените сальник штока.

На этом полная разборка КПП выполнена. Сборка и ремонт КПП Ваз 2109 выполняется в последовательности, обратной разборке с учетом замены изношенных деталей КПП на новые.

Ремонт коробки передач ВАЗ-2109 — Легкое дело

Ремонт коробки передач ВАЗ-2109

Ремонт коробки передач ВАЗ-2109 включает следующие этапы:

1. Снимаем КПП с ВАЗ-2109. Очищаем ее от грязи с помощью солярки и тряпки.

2. Вынимаем щуп уровня масла из КПП.

3. Устанавливаем КПП картер сцепления вертикально, открутив болт 1 и 2 гайки 3 крепления кронштейна троса сцепления. Снимаем кронштейн 2 троса сцепления с КПП.

4. Откручиваем остальные 4 гайки крепления задней крышки.

5. Снимаем заднюю крышку.

6. Откручиваем болт крепления вилки 5-й передачи.

7. Зафиксируем валы КПП от проворачивания.

8. Откручиваем гайку крепления первичного вала .

9. Откручиваем гайку крепления вторичного вала .

10. Снимаем шестерню 5-й передачи вместе с синхронизатором и вилкой с вторичного вала.

11. Снимаем с синхронизатора упорную пластину и вынимаем из паза муфты вилку.

12. Снимаем шестерню 5-й передачи с синхронизатора с кольцом 1.

13. Снимаем втулку с вторичного вала.

14. Снимаем шестерню 5-й передачи с первичного вала.

15. Откручиваем четыре винта с использованием ударной отвертки и снимаем упорную шайбу 2 с вторичного вала.

16. Снимаем стопорные кольца подшипников валов.

17. Откручиваем 3 пробки фиксаторов и осторожно извлекаем шарики фиксаторов.

18. Откручиваем пробку фиксатора заднего хода, снимаем уплотнительное кольцо и извлекаем пружину фиксатора.

19. Извлекаем шарик фиксатора, наклонив коробку.

20. Откручиваем 12 гаек и болт крепления картера КПП.

21. Отделяем картер КПП от картера сцепления, вставив отвертку в пазы

22. Снимаем картер коробки передач с картера сцепления.

23. Откручиваем болты вилок переключения передач 1–2-й и 3–4-й.

24. Приподнимаем шток переключения 1–2-й передач, он выйдет из опоры 3, затем поворачиваем против часовой стрелки, выйдет его головка 1 из зацепления с блокировочной скобой.

25. Поверните шток переключения 3–4-й передач и снимаем шток с вилкой.

26. Поворачиваем шток включения 5-й передачи и снимаем шток.

27. Вынимаем ось шестерни заднего хода.

28. Сдвигаем шестерню заднего хода до упора в механизм передач, поворачиваем на 30– 40 градусов и снимаем промежуточную шестерню.

29. Вынимаем первичный и вторичный валы.

30. Вынимаем дифференциал из картера сцепления.

31. Отворачиваем 3 болта механизма передач и снимаем механизм передач.

32. Вынимаем магнит из картера сцепления.

33. Отворачиваем гайку крепления и снимаем корпус с шестерней привода спидометра.

34. Выворачиваем из картера КПП выключатель заднего хода.

35. Выпрессовываем подшипник вторичного вала.

36. Снимаем маслосборник.

37. Выпрессовываем подшипник первичного вала.

38. Запрессовываем новые передние подшипники валов в картер сцепления.

39. Сдвигаем кромку защитного чехла штока.

40. Отворачиваем болт рычага передач, снимаем рычаг и вынимаем шток передач.

41. Заменяем порванный защитный чехол шарнира штока.

42. Для замены сцепления выпрессовываем сальники.

43. Удалите небольшие повреждения шлифовальной шкуркой на картере сцепления и КПП или замените.

44. Проверяем посадочные места под подшипники в картере сцепления и КПП. Если есть износ, то заменяем картеры.

45. Проверяем роликовые подшипники, при повреждении заменяем.

46. Проверяем штоки переключения передач, при повреждении заменяем.

47. Проверяем сальники полуосей, при наличии дефекта сальники заменяем.

48. Проверяем сальник первичного вала и сальник штока в передач, при дефектах заменяем.

49. Очищаем магнит от частиц износа элементов. Если есть повреждения, заменяем магнит.

50. Очищаем от старого герметика плоскости картеров сцепления и КПП. Собираем КПП в обратном порядке.

51. Устанавливаем валы в картер сцепления.

52. Обильно смазываем все трущиеся элементы маслом.

54. Не забываем устанавливать на место магнит.

55. Перед установкой картера КПП на картер сцепления наносим на их герметик по всему периметру.

Подробнее о работе сцепления можно почитать тут .

Устанавливаем двигатель на автомобиль и радуемся хорошим динамическим характеристикам после ремонта коробки передач ВАЗ-2109.

http://vsepoedem.com

Ремонт и доработка коробки передач ВАЗ 2109

Пожалуй, любой автолюбитель хочет, чтобы его «железный конь» был мощнее и динамичнее. Однако далеко не все имеют возможности, знания и желание копаться в двигателе автомобиля. И именно поэтому многие автолюбители стараются изменить трансмиссию, ведь с помощью небольших доработок можно значительно улучшить автомобиль, не изменяя ничего в моторе.

Автомобили ВАЗ 2109 очень популярны среди отечественных автолюбителей, при этом многие из них вскоре после покупки машины начинают задумываться о тюнинге. За то время, что существует «девятка», было придумано много различных способов доработки машины, при этом большая их часть доступна обычным владельцам «девятки».


Коробка передач автомобиля ВАЗ 2109

Самое сложное при тюнинге коробки передач «девятки» заключается в подборе передаточных чисел – все передаточные числа необходимо подбирать для каждой передачи. Чтобы сделать это, вы должны найти подходящие шестерёнки, и при выборе шестерёнок следует учитывать характерный вам манер езды: агрессивный или же спокойный.

Сейчас в автомобильных магазинах можно приобрести «спортивные ряды КПП». В этих наборах имеются шестерёнки с измененными передаточными числами. Самое приятное состоит в том, что такие наборы могут быть разными, они уже адаптированы под определённый стиль вождения. А некоторые наборы к тому же позволяют добавить «девятке» шестую передачу, благодаря чему динамика автомобиля должна увеличиться ещё больше. Правда, такие наборы стоят довольно дорого.

У данных наборов имеется только один недостаток – они немного снижают максимальную скорость автомобиля. С другой стороны, после установки спортивных рядов ваша машина намного быстрее будет набирать скорость при старте.

Установив на машину спортивные ряды, можно также поставить и новую главную пару, у которой будет другое передаточное число. На спортивных авто данное число можно довести до 5,5, в то время как на стандартных «девятках» оно обычно колеблется от 3,7 до 4,1.


Привод и дифференциал автомобиля ВАЗ 2109

Занимаясь тюнингом или ремонтом авто ВАЗ 2109, следует уделить внимание и приводу. На переднеприводных машинах устанавливается привод, состоящий из двух шарниров, между которым располагается вал.

Решив сделать свой автомобиль более спортивным, вам потребуется заменить привод. Так, обычно для спортивных машин валы изготавливают из более лёгких труб, а вот шарниры делают, наоборот, массивнее. Возможно, потребуется заменить и ступицы – дело в том, что у обычных автомобилей немного другие шпицы приводов, чем у спортивных автомобилей.

После установки новых шестерёнок вам, возможно, потребуется провести блокировку дифференциала, так как у машин, близких к гоночным, он ухудшает управляемость. Если вы не хотите столкнуться с необходимостью проведения дорогостоящего ремонта авто ВАЗ 2109, то лучше всего обратиться к специалистам для блокировки дифференциала – любое неверное действие при снятии дифференциала может привести к поломке коробки передач.


Вообще дифференциал нужен для улучшения управляемости машины, также он помогает немного снизить скорость износа резины. Однако, как уже было сказано выше, управляемость спортивных авто он скорее снижает.

Для самоблокирующегося дифференциала наиболее важным параметром является коэффициент блокировки, значение которого не превышает единицы. Отметим, что 1 ставят обычно только на внедорожники, и то не всегда. Обычному же автомобилю достаточно дифференциала с коэффициентом до 0,7 – тут всё зависит от условий, в которых эксплуатируется машина. Помните, что слишком высокий коэффициент может привести к тому, что во время прохождения поворота передняя ось окажется просто снесена.

ᐅ Ремонт КПП (МКПП) — цена в Москве, стоимость коробки передач на YouDo

Ремонт КПП (МКПП) на YouDo

Исполнители Юду делают качественный ремонт КПП по самой доступной цене в Москве. Обратитесь к зарегистрированным на сайте youdo.com профессионалам, если коробка переключения передач вашего авто неисправна. Специалисты, которых вы найдёте с помощью сервиса Юду, недорого предоставят услуги технического обслуживания грузовых и легковых автомобилей.

Почему следует обратиться к профессионалу?

Поломка коробки-автомат может привести к непоправимым последствиям, поэтому нужно доверить её диагностику и ремонт квалифицированным мастерам. У специалистов, которых вы найдёте с помощью Юду, большой опыт в выполнении ремонтных работ.

Зарегистрированные на сайте youdo.com специалисты качественно ремонтируют автоматические коробки передач на:

  • легковых авто любых марок и моделей
  • грузовых автомобилях
  • специальной технике (тракторах, асфальтоукладчиках, бульдозерах и многих других)

Прежде чем выполнять работы по ремонту, исполнитель Юду проведёт тщательную диагностику. Только выявив причину неполадки в работе механизма АКПП, мастер сможет правильно устранить неисправности.

Исполнители Юду осуществляют профессиональный ремонт автоматических коробок передач и качественно выполняют все виды работ, включая:

  • сборку блока управления
  • замену сцепления
  • установку нового гидроблока
  • заправку масляного насоса
  • замену втулки и так далее

С помощью сервиса Юду вы найдёте квалифицированного мастера, который качественно и быстро сделает ремонт автомобильной КПП любого типа:

  • автоматического
  • механического
  • роботизированного

Выполняя ремонтные работы, исполнители Юду применяют специальное современное оборудование и надёжные инструменты. Также зарегистрированные на сайте youdo.com профессионалы используют оригинальные запасные части.

Срок выполнения ремонтных работ

Исполнители Юду сделают ремонт коробки передач в короткие сроки. Мастер проведёт диагностику и сообщит время, которое необходимо ему для осуществления работ.

Срок выполнения ремонта зависит от:

  • сложности поломки
  • типа коробки передач
  • марки автомобиля

Почему стоит заказать техническое обслуживание авто на Юду?

Обратитесь к исполнителям Юду, если нужно срочно отремонтировать коробку передач машины. На сайте youdo.com зарегистрированы опытные мастера, которые сделают капитальный ремонт модуля управления вашего авто и предоставят другие услуги по обслуживанию недорого.

С помощью сервиса Юду вы найдёте квалифицированных специалистов сервисных центов по обслуживанию авто. Также профессиональный ремонт КПП вам могут предложить частные мастера, зарегистрированные на youdo.com.

Исполнители выполняют работы по ремонту АКПП автомобилей с выездом на дом по любому указанному адресу. У специалистов Юду всегда при себе необходимое оборудование и инструменты для обслуживания авто. Зарегистрированные на сайте Юду профессионалы с опытом работы готовы приехать в любое удобное для вас время.

Заказав услуги исполнителей Юду, вы получите:

  • бесплатный выезд специалиста на дом
  • комплексную диагностику коробки передач
  • выполнение работ с использованием современного оборудования и оригинальных запчастей
  • качественное обслуживание авто по доступной цене

Стоимость обслуживания АКПП автомобиля

У зарегистрированных на сайте Юду специалистов самая низкая в Москве стоимость ремонта коробки передач. Выбранный исполнитель может провести обслуживание АКПП по предложенной вами цене. Назначая стоимость, ориентируйтесь на средние расценки на ремонт. Прайс-лист вы найдёте на сайте Юду, а также в профилях исполнителей.

Чтобы заказать у исполнителей Юду недорогой ремонт КПП автомобиля, оформите заявку, заполнив форму на сайте youdo.com.

Изменение динамики микротрубочек синергически токсично с ингибированием контрольной точки сборки веретена

Введение

Хромосомная нестабильность (CIN) — это процесс, посредством которого хромосомы неправильно расщепляются во время митоза. CIN приводит к образованию клеток с аномальным содержанием ДНК, состояние, известное как анеуплоидия. Поскольку три из четырех видов рака являются анеуплоидными (Weaver & Cleveland, 2006; Foijer et al, 2008; Duijf et al, 2013), CIN считается важным фактором онкогенеза. Действительно, CIN был связан с метастазированием (Bloomfield & Duesberg, 2016; Xu et al, 2016), повышенной вероятностью лекарственной устойчивости (Lee et al, 2011; Sansregret & Swanton, 2017) и, как правило, снижением выживаемости пациентов (Carter et al. al, 2006; Walther et al, 2008; McGranahan et al, 2012).В то время как частое возникновение CIN и возникающая в результате анеуплоидия при раке обычно объясняется приобретенной способностью раковых клеток адаптировать свою палитру онкогенных признаков по мере развития опухоли, продолжающаяся неправильная сегрегация хромосом также оказывает негативное влияние на раковые клетки. Недостатком CIN для раковых клеток является то, что большинство недавно приобретенных кариотипов приводят к снижению пролиферации (Torres et al, 2007; Williams et al, 2008; Foijer et al, 2017) и индукции стрессов, вызванных анеуплоидией (Torres et al, 2010). .В дополнение к этому продолжающаяся миссегрегация вызывает дальнейшее структурное повреждение ДНК (Zhang et al, 2015; MacKenzie et al, 2017), что вместе с неблагоприятным кариотипом приводит к гибели клеток (Kops et al, 2004; Burds et al, 2005; Santaguida). et al, 2017) или старение (Andriani et al, 2016).

Для защиты от CIN в клетках имеются механизмы, поддерживающие правильное наследование хромосом. Контрольная точка сборки веретена (SAC) является одним из таких механизмов, предотвращающих CIN путем ингибирования начала анафазы до тех пор, пока все хромосомы не будут должным образом прикреплены к двум противоположным полюсам веретена, подробно рассмотренные Musacchio and Salmon (2007).Например, вмешательство в SAC путем инактивации ключевых компонентов контрольной точки приводит к частым случаям неправильной сегрегации хромосом и обычно используется для изучения последствий CIN in vitro и in vivo (Kops et al, 2004; Foijer et al, 2013). , 2014, 2017).

Хотя нарушение SAC редко встречается при раке человека (Gordon et al, 2012), многие виды рака демонстрируют признаки частичного нарушения SAC, например, в результате повышенной экспрессии белков, играющих непосредственную роль в SAC, или их регуляторов, такие как мутации Rb, которые приводят к повышенной экспрессии Mad2 и, таким образом, вызывают фенотип CIN (Pfau & Amon, 2012).Кроме того, измененная динамика микротрубочек (МТ) является еще одним источником CIN при многих видах рака (Bakhoum et al, 2009; Ertych et al, 2014; Stolz et al, 2015), поскольку восстановление динамики тубулина до нормального уровня может снизить частоту CIN во многих раковых клетках. линии (Ертыч и др., 2014). И наоборот, обычно используемые противораковые препараты, такие как паклитаксел или винкристин, влияют на скорость полимеризации МТ, тем самым увеличивая скорость CIN в раковых клетках. Это наблюдение предполагает, что наложение фенотипов CIN на раковые клетки является мощной стратегией искоренения опухолей.Однако пока неясно, целесообразно ли обострение CIN в клетках с ранее существовавшим фенотипом CIN.

Поскольку CIN и анеуплоидия отличают раковые клетки от здоровых клеток, обе они становятся привлекательными мишенями для терапии рака. Чтобы выявить потенциальную общую уязвимость анеуплоидных клеток, Танг и др. (2011) провели скрининг низкомолекулярных соединений, который показал, что вызывающее энергетический стресс соединение 5-аминоимидазол-4-карбоксамид рибонуклеотид (AICAR) более токсично для анеуплоидных клеток, чем эуплоидные. клетки (Tang et al, 2011).Эта специфичная для анеуплоидии токсичность была подтверждена в экспериментах на клеточных культурах, а также на моделях рака у мышей, что является многообещающим результатом для будущих методов лечения анеуплоидного рака.

Хотя CIN и анеуплоидия тесно связаны, CIN оказывает дополнительное влияние на физиологию и рост клеток в дополнение к тем, которые возникают в результате анеуплоидии (Schukken and Foijer, 2018). Поскольку CIN стимулирует гетерогенность кариотипа, тем самым увеличивая скорость эволюции, которую раковые клетки используют для приобретения новых функций и адаптации (McGranahan et al, 2012; Giam & Rancati, 2015), нацеливание на CIN обеспечит даже более мощные средства для уничтожения раковых клеток, чем только анеуплоидия.

Таким образом, в этом исследовании мы провели два небольших скрининга лекарств: один для выявления низкомолекулярных соединений, нацеленных на анеуплоидные клетки, а другой для поиска соединений, которые более токсичны для клеток CIN, чем для хромосомно стабильных клеток. Для этой цели мы выбрали набор лекарствоподобных молекул из списка лекарств, которые уже используются в клинике или проходят клинические испытания на продвинутой стадии. Соединения были дополнительно отобраны по их потенциальной роли в нацеливании на CIN или анеуплоидные клетки, например, на выживаемость клеток (Dekanty et al, 2012; Foijer et al, 2013), пролиферацию (Williams et al, 2008; Ben-david et al, 2014; Gogendeau et al, 2015; Sheltzer et al, 2017), процессинг белков (Oromendia et al, 2012; Stingele et al, 2012), репарация ДНК (Bakhoum et al, 2014, 2018), дерегуляция транскрипции (Upender et al, 2004; Stingele et al, 2012) и клеточный метаболизм (Williams et al, 2008; Tang et al, 2011), поскольку эти процессы обычно не регулируются в анеуплоидных клетках.Действительно, наш скрининг соединений, нацеленных на анеуплоидию, выявил соединение, нацеленное на клеточный метаболизм, подтверждая более ранние выводы из лаборатории Amon (Tang et al, 2011). Кроме того, скрининг CIN показал, что ингибитор Src SKI606 (бозутиниб) является синергически токсичным для клеток с ослабленным SAC. Мы обнаружили, что механизм, лежащий в основе токсичности SKI606 в клетках с дефицитом SAC, возникает из-за нарушения регуляции скорости полимеризации тубулина, обусловленной ингибированием Src. Таким образом, наши результаты показывают, что сочетание ингибирования SAC с нарушением регуляции тубулина синергетически токсично для клеток и может предоставить мощные средства для нацеливания на раковые клетки с фенотипом CIN.

Результаты

CIN и возникающая в результате анеуплоидия приводят к нарушению регуляции транскриптома и протеома (Tang et al, 2011; Stingele et al, 2012; Foijer et al, 2013, 2014) и могут вызывать задержку клеточного цикла, старение или апоптоз ( Giam & Rancati, 2015; Andriani et al, 2016; Santaguida et al, 2017; Chunduri & Storchová, 2019). Кроме того, продолжающаяся CIN может привести к дальнейшему повреждению ДНК (Zhang et al, 2015; MacKenzie et al, 2017). Поэтому мы пришли к выводу, что нацеливание на процессинг РНК или белка, регуляцию транскрипции, апоптоз или репарацию ДНК может быть особенно токсичным для анеуплоидных клеток и клеток, проявляющих фенотип CIN.Поскольку CIN и анеуплоидия — это разные понятия (Schukken & Foijer, 2018) и имеют разные последствия для клеток (Stingele et al, 2012; Andriani et al, 2016; Schukken & Foijer, 2018), анеуплоидия и CIN могут создавать разные терапевтические уязвимости. Чтобы проверить это, мы провели два небольших скрининга лекарств: один для выявления соединений, которые избирательно предотвращают размножение анеуплоидных клеток, а другой — для выявления небольших молекул, которые избирательно воздействуют на клетки CIN.

Небольшой скрининг лекарств для выявления соединений, которые избирательно воздействуют на анеуплоидные клетки

Сначала мы отобрали 95 лекарствоподобных молекул из библиотеки лекарств, состоящей из лекарств, воздействующих на процессы, на которые могут полагаться анеуплоидные клетки или клетки CIN, и которые уже используются в в клинике или проходят клинические испытания (таблица S1).Затем мы определили начальную концентрацию каждого наркотика, который будет использоваться при скрининге. Для этого мы подвергали клетки RPE1 дикого типа (почти диплоидная нераковая клеточная линия, полученная из эпителия сетчатки [Soto et al, 2017]) уменьшающимся концентрациям препаратов, начиная с 10 мкМ для всех соединений, и сравнивали клетки от пролиферации клеток, подвергшихся воздействию лекарственного средства, до пролиферации клеток, обработанных ДМСО, в течение 7 дней. Мы намеренно выбрали нетрансформированную клеточную линию, так как это позволяет изучать комбинированный эффект CIN и лекарств в невозмущенной обстановке.

Затем мы подвергли стабильные анеуплоидные клетки RPE-1, трисомные по хромосомам (хр.) 5 и 12 (рис. S1A, [Stingele et al, 2012]), такому же режиму лекарственной обработки и сравнили пролиферацию между диплоидными и анеуплоидными клетками. Клетки RPE1 (дополнительные данные 1) с использованием высококонтентного имидж-сканера IncuCyte. На рис. S1B схематично показаны схема эксперимента и подход к анализу. Обратите внимание, что анеуплоидные клетки RPE1 показали умеренно сниженную скорость пролиферации по сравнению с контрольными клетками RPE1 (рис. S1C) в соответствии с более ранними наблюдениями (Williams et al, 2008), которые мы скорректировали при анализе кривых роста.Чтобы количественно оценить различия между клетками дикого типа и анеуплоидными клетками RPE1, мы сравнили площадь под кривой (AUC) как меру кумулятивного роста клеток (рис. 1A и B) и наклон логарифмического роста как меру скорости пролиферации ( Рис. 1C и D), см. также раздел «Материалы и методы». В то же время этот скрининг выявил некоторые препараты, к которым анеуплоидные клетки RPE1 были более чувствительны (log 2 > 0; P < 0,05) или менее чувствительны (log 2 < 0; P < 0.05), мы обнаружили только одно соединение (# 2379, ZLN005; регулятор транскрипции PGC-1α), для которого эффект был значительным после коррекции множественного тестирования Бонферрони (рис. 1А) в одном из двух скринингов. Комбинированные эффекты анеуплоидии и ZLN005 действуют синергетически, что оценивается тестом независимости Блисса (эффект на 50% сильнее, чем аддитивный, P = 3,2E-3, [Zhao et al, 2014]). Действительно, дальнейшая проверка подтвердила дефект селективного роста анеуплоидных клеток RPE1, вызванный ZLN005 (рис. 1E).Однако, поскольку ZLN005 воздействует на энергетический метаболизм, что очень похоже на то, что другие обнаружили для AICAR (Tang et al, 2011), мы не стали исследовать это соединение дальше. Таким образом, мы пришли к выводу, что наш скрининг анеуплоидии не выявил новых целевых уязвимостей анеуплоидных клеток, и затем провели скрининг соединений, которые избирательно ингибируют CIN-клетки.

Рисунок S1. Проверка линии анеуплоидных клеток и настройка экрана.

(A) Числа хромосом, оцененные по метафазному распространению в контрольных клетках RPE1 и RPE1 + трисомия 12 + трисомия 5 (Ts12 TS5).На одно состояние подсчитывали не менее 50 метафаз. Модальные числа хромосом показаны выше и отмечены красной линией. (B) Настройка экрана Aneuploid и типы данных, используемые для анализа. (C) Кривая роста контрольных клеток RPE1 и клеток RPE1 Ts12 Ts5 во времени. Данные были получены с помощью последовательных ежедневных микроскопических изображений и проанализированы с помощью FIJI-PHANTAST. Данные включают не менее трех технических повторов, в каждом из которых три биологических повтора. Столбики погрешностей указывают SEM. Данные для контрольных кривых ДМСО представлены на рисунках 1E и S3G.

Рисунок 1. Анеуплоидные клетки чувствительны к препарату, усиливающему метаболизм.

(A, B, C, D) Контрольные клетки RPE1 и стабильные анеуплоидные клетки RPE1 Ts12 Ts5 подвергали скринингу с 95 лекарствами, каждое лекарство подвергали скринингу в трех экземплярах. Повторно исследовано 45 препаратов. Наносили на график значения P и величину эффекта для действия препарата на клетки RPE1 и RPE1 Ts12 Ts5. (A, B, C, D) Данные были проанализированы путем количественного определения площади под кривой (AUC, A, B) и анализа наклона (C, D) как первоначального скрининга (A, C), так и повторного скрининга лекарств. (Б, Г).Препараты с разницей >1 и значением P <0,05 после коррекции Бонферрони обозначены синим цветом. (E) Валидационные кривые роста контрольных клеток RPE1 и клеток RPE1 Ts12 Ts5 с 10 мкМ и без 2,379. Данные были получены с помощью последовательных ежедневных микроскопических изображений и проанализированы с помощью FIJI-PHANTAST. Все данные включают как минимум три биологических повтора, каждый из которых имеет три технических повтора. Столбики погрешностей указывают SEM. P -значения рассчитаны в двустороннем тесте t для AUC с поправкой на контроль клеточной линии.Кривые контроля ДМСО показаны на рисунках S1C и S3G.

Клеточная линия условного нокдауна Mad2 для моделирования CIN

Для скрининга соединений, которые избирательно воздействуют на клетки с фенотипом CIN, нам нужна была клеточная линия, в которой CIN можно было бы индуцировать индуцируемым образом, поскольку долговременные фенотипы CIN обычно выбран против в культуре ткани (Kops et al, 2004; Foijer et al, 2014). Для этого мы сконструировали клетки RPE1 hTert, в которых SAC можно ингибировать посредством экспрессии индуцируемой доксициклином конструкции Mad2 shRNA, далее именуемой клетками RPE1 с условным нокдауном Mad2 (Mad2 cKD ).Эффективность нокдауна Mad2 была количественно определена с помощью количественной ПЦР (рис. 2А) и вестерн-блоттинга (рис. 2В), которые показали, что уровни Mad2 снижались на 90% в течение 3 дней лечения доксициклином. Чтобы проверить, было ли ингибирование Mad2 достаточным для облегчения SAC, мы подвергли клетки воздействию нокодазола, яда МТ, определили накопление в митозе путем количественного определения фосфогистона h4 с помощью проточной цитометрии и обнаружили, что dox-обработка в течение 3 дней или дольше была достаточной для полного облегчают SAC в клетках Mad2 cKD RPE1 (рис. 2C).Поэтому во всех последующих экспериментах с участием клеток Mad2 cKD RPE1 клетки предварительно обрабатывали доксициклином в течение как минимум 3 дней перед введением лекарственного средства. Как и ожидалось, мы обнаружили, что Mad2 cKD умеренно снижает пролиферацию клеток (~ 25%), что мы исправили в наших последующих анализах в каждом из наших экспериментов (рис. S2A). Затем мы определили, действительно ли ингибирование SAC в клетках Mad2 cKD RPE1 приводит к фенотипу CIN. С этой целью мы количественно оценили интерфазные и митотические аномалии, используя визуализацию живых клеток (рис. 2D и E).Действительно, клетки Mad2 cKD демонстрировали значительно повышенную скорость CIN: 46% клеток Mad2 cKD RPE1 демонстрировали митотические аномалии по сравнению только с 1% контрольных клеток. Кроме того, с 2 до 24% увеличилась доля клеток с интерфазными остатками митотических аберраций в виде микроядер. Наконец, мы количественно оценили анеуплоидию с помощью секвенирования всего генома одной клетки (Bakker et al, 2016; van den Bos et al, 2016). В то время как контрольные клетки RPE1 демонстрируют небольшую анеуплоидию (2 из 114 секвенированных клеток), за исключением известной структурной аномалии для хромосомы 10 (рис. 2F и Worrall et al (2018)), 45% обработанных доксом клеток Mad2 cKD обнаруживали от одного до нескольких аневсомии на клетку (76 из 169 клеток, рис. 2G) в течение 5 дней после индукции кшРНК Mad2, что подтверждает существенный фенотип CIN.Вместе эти особенности делают клетки Mad2 cKD очень подходящими для скрининга соединений, нацеленных на CIN-клетки.

Рисунок 2. Создание клеточной линии для условного CIN.

(A) Количественная ПЦР для определения уровней РНК Mad2 в зависимости от времени в клетках Mad2 cKD RPE1. (B) Вестерн-блоттинг уровней Mad2 в зависимости от времени в RPE1 в клетках Mad2 cKD RPE1. (C) Митотическое накопление контрольных клеток, зараженных нокодазолом, и клеток Mad2 cKD RPE1, измеренное с помощью фосфорилированного гистона h4. (D, E) Количественная оценка митотических фенотипов контрольных клеток и клеток Mad2 cKD RPE1, оцененных с помощью покадровой визуализации интерфазных клеток (D) и митотических клеток (E). «n» относится к числу проанализированных клеток, P — значения из критерия хи-квадрат. Данные также показаны на рис. 5H. (F, G) Данные полногеномного секвенирования отдельных клеток, количественно определенные с помощью AneuFinder для контрольных клеток RPE1 (F, 114 клеток, 2 анеуплоидных) и клеток Mad2 cKD RPE1 после 5-дневного лечения доксициклином (G, 169 клеток, 76 анеуплоид).Цвета относятся к состоянию числа копий для каждой хромосомы (фрагмента).

Рисунок S2. Настройка экрана CIN.

(A) Кривая роста контрольных клеток RPE1 и RPE1 Mad2 cKD во времени. Данные были получены с помощью последовательных ежедневных микроскопических изображений и проанализированы с помощью FIJI-PHANTAST. Столбики погрешностей показывают SEM трех биологических повторов, каждый из которых имеет три технических повтора. (B) Настройка экрана CIN и типы данных, используемые для анализа.

Ингибитор Src SKI606 избирательно нацеливается на клетки Mad2

cKD

Затем мы использовали клетки Mad2 cKD RPE1 для скрининга соединений, которые избирательно ингибируют размножение клеток CIN (рис. S2B).Для этого мы подвергли контрольные клетки и клетки Mad2 cKD RPE1 воздействию 58 соединений (таблица S2) и сравнили максимальную скорость пролиферации и кумулятивное число клеток между клетками Mad2 cKD RPE1 и контрольными клетками RPE1, используя ту же установку, что и для скрининга анеуплоидии. описано выше. Чтобы оценить как краткосрочные, так и долгосрочные эффекты препаратов, мы количественно определили пролиферацию и кумулятивное количество клеток в течение первых 4 дней и дней 5-8 отдельно (рис. S2B). Интересно, что мы обнаружили, что ингибитор mTor AZD8055 (соединение № 1561) при 0.1 мкМ действовал синергетически с CIN в снижении количества клеток (на 31% больше, чем аддитивный эффект; P = 2,7E-4, тест независимости Блисса) в течение первых 4 дней скрининга, но стал полностью токсичным как для контроля, так и для Mad2 cKD , начиная с 5-го дня (рис. 3A и B и дополнительные данные 2 для всех кривых роста). И наоборот, мы обнаружили, что ингибитор Src SKI606 (соединение № 1407) в концентрации 0,1 мкМ действовал синергически с CIN (эффект на 48% выше, чем при добавке; P = 7,3E-3, тест независимости Блисса) во второй половине скрининга ( Рис. 3C и D и дополнительные данные 2) и меньше в первой половине экрана.Обратите внимание, что наблюдаемые эффекты не были связаны с обработкой доксициклином, необходимой для индукции кшРНК Mad2, поскольку доксициклин сам по себе не влиял на пролиферацию (рис. S3A). Затем мы хотели проверить наши результаты в независимых анализах роста. В дополнение к AZD8055 и SKI606 мы также повторно тестировали соединения № 2180 (TMP195, ингибитор HDAC), № 2250 (трифторацетат CHR6494, ингибитор Haspin), № 2831 (EPZ015666, ингибитор Prmt5), № 1801 (пироксамид, ингибитор HDAC 1), № 1803 (MS 275, ингибитор HDAC 1 и 3) и № 2008 (теновин 1, ингибитор SIRT 1 и 2), которые также показали некоторый эффект при первичном скрининге CIN.Для этих проверочных экспериментов пролиферацию количественно определяли ежедневными измерениями слияния клеток по изображениям под микроскопом, как описано в разделе «Материалы и методы». Эти эксперименты показали, что хотя SKI606 (#1407), AZD8055 (#1561) и EPZ015666 (#2831) воспроизводимо ингибировали рост клеток Mad2 cKD RPE1 в большей степени, чем контрольные клетки (рис. 4A–F), это не было в случае TMP195, CHR6494, питоксамида, MS 275 и теновина (рис. S3B-G). Учитывая, что SKI606 оказывает наибольшее ингибирующее действие на рост клеток Mad2 cKD RPE1, особенно при 0.5 мкМ (рис. 4Е), мы решили продолжить изучение этого соединения. Интересно отметить, что SKI606 не оказывал значительного влияния на стабильные анеуплоидные клетки (рис. S3G-J), и наоборот, что ZLN005 (№ 2379), идентифицированный при скрининге анеуплоидии, не оказывал существенного влияния на CIN-клетки Mad2 cKD . (рис. S3K), предполагая, что соединения, которые избирательно токсичны для стабильных анеуплоидных клеток, не обязательно нацелены на клетки CIN, и наоборот.

Рисунок 3. Скрининг соединений, которые избирательно убивают CIN-клетки, выявил несколько кандидатов.

(A, B, C, D) Кривые роста контрольных клеток и клеток Mad2 cKD RPE1 анализировали в течение первой половины (1–4 сут) (A, B) и второй половины (5–8 сут) экрана (С, D). (A, B, C, D) Отношения не-CIN к CIN для AUC (A, C) и анализа наклона (B, D) были построены для каждого лекарственного средства в зависимости от значения P . Все препараты с log различия >|0,15| и P -value <0,05 нанесены на график; препараты со значениями P <0,05 после коррекции Бонферрони отмечены синим цветом.

Рисунок S3. Проверка настройки экрана CIN и попаданий.

(A) Кривая роста обработанных доксициклином клеток RPE1 с 0,5 мкМ соединения #1407 или без него. Данные были получены с помощью последовательных ежедневных микроскопических изображений и проанализированы с помощью FIJI-PHANTAST. Каждая точка данных включает три технические тройки. P — значения рассчитываются на основе двустороннего теста t . (B, C, D, E, F) Кривые роста контрольных клеток и клеток Mad2 cKD RPE1, обработанных соединениями № 2180 (B), № 2250 (C), № 1801 (D), № 1803 (E) и № 2008 (F) соответственно.Данные были получены с помощью последовательных ежедневных микроскопических изображений и проанализированы с помощью FIJI-PHANTAST. Каждая точка данных включает три технические тройки. P -значения рассчитываются из одностороннего теста t . Данные для кривых контроля ДМСО являются общими для (B) и рис. S3K, между (D), (E) и (F) и между (C) и рис. 4C и F. (G) Кривые роста RPE1 контроля и Клетки RPE1 Ts12 Ts5 с 0,5 мкМ соединения № 1407 или без него. Данные были получены с помощью последовательных ежедневных микроскопических изображений и проанализированы с помощью FIJI-PHANTAST.Данные включают три биологических повтора, каждый из которых имеет три технических повтора. P — значения рассчитываются на основе двустороннего теста t . Данные для контрольных кривых ДМСО представлены на рисунках 1E и S1C. (H, I, J) Полученные IncuCyte кривые роста клеток RPE1 и RPE1 (Ts12 Ts5), обработанных 0,1 (H), 0,5 (I) и 1 мкМ соединения № 1407 (J). Данные представляют собой три технических повтора для каждого условия. P — значения рассчитываются по двустороннему тесту t . (K) Кривая роста контрольных клеток RPE1 и клеток RPE1 Mad2 cKD с 10 мкМ соединения #2379 или без него.Данные были получены с помощью последовательных ежедневных микроскопических изображений и проанализированы с помощью FIJI-PHANTAST. Данные включают три биологических повтора, каждый из которых имеет три технических повтора. P — значения рассчитываются на основе двустороннего теста t . Данные для контрольных кривых ДМСО представлены на рис. 3В. (L, M) Полученные с помощью IncuCyte кривые роста (дни 1–4) контрольных клеток и клеток Mad2 cKD RPE1, обработанных 25 мкМ SKI-1 (L) или 0,5 мкМ соединения № 1407 (M) в шести повторах каждый . P — значения рассчитываются на основе двустороннего теста t .Данные для контрольных кривых ДМСО являются общими для (L), (M) и рис. S5C. Столбики погрешностей указывают SEM между измерениями. Тесты t основаны на AUC, скорректированной для контрольных клеточных линий. (N) Вестерн-блоттинг для определения эффективности нокдауна Src для трех конструкций кшРНК, индуцируемых доксициклином. Актин используется в качестве контроля загрузки. Цифры под пятнами относятся к эффективности нокдауна и нормализованы для актина и соответствуют образцу, не обработанному доксициклином.

Рисунок 4. Проверка соединений-кандидатов, которые избирательно воздействуют на клетки CIN.

(A, B, C, D, E, F) Кривые роста контрольных клеток и клеток Mad2 cKD RPE1, обработанных 0,1 мкМ (A) и 0,01 мкМ (B) соединения #1561, (C) 1 мкМ соединения № 2831, (D, E, F) 0,1 мкМ, 0,5 мкМ и 1 мкМ 1407 соответственно. Данные были получены с помощью последовательных ежедневных микроскопических изображений и проанализированы с помощью FIJI-PHANTAST. Каждая точка представляет собой минимум три биологические повторности, каждая из которых содержит три технические повторности. На графике показан процент слияния (покрытие ячеек) в логарифмическом масштабе с течением времени.Столбики погрешностей указывают SEM. P -значения рассчитываются из парных, односторонних t тестов AUC с поправкой на контроль клеточной линии. Кривые RPE1 DMSO и Mad2 cKD DMSO являются общими для (A) и (B), а также для (C) и (F) и рис. S3C, а также для (D) и (E). (G, H) Кривые роста IncuCyte для контроля и клеток Mad2 cKD RPE1, обработанных ингибиторами Src SKI-1 (G) или соединением № 1407 (H, SKI606) в течение 8–16 дней. (I) Кривые роста IncuCyte для контрольных и обработанных реверсином клеток RPE1 с условным нокдауном Src и без него.Все точки включают данные для шести технических повторностей. Столбики погрешностей относятся к SEM, и значения P рассчитывали из двустороннего теста t AUC, скорректированного для контролей клеточных линий. Данные для контрольных кривых ДМСО являются общими для (G, H) и фиг. 5G.

SKI606 был разработан как ингибитор тирозинкиназы, нацеленный на Bcr-Abl (Golas et al, 2003) и Src (Boschelli et al, 2001). Однако клетки RPE1 не имеют слияния Bcr-Abl, что делает киназу Src вероятной мишенью. Чтобы проверить, действительно ли наблюдаемый эффект SKI606 на пролиферацию действует через Src, мы затем сравнили эффект SKI606 с эффектом другого ингибитора Src, SKI-1.Мы обнаружили, что SKI-1 продемонстрировал аналогичную синергию с CIN (рис. 4G и S3L; эффект на 15–40% больше, чем аддитивный; тест независимости Блисса, P -значения 1,5E-3 и 1,1E-3 для первых 4 и последних 4 d соответственно) как SKI606 (фиг. 4H и S3M) в ингибировании пролиферации клеток Mad2 cKD RPE1 при минимальном влиянии на пролиферацию контрольных клеток RPE1. Однако, поскольку низкомолекулярные соединения могут иметь (перекрывающиеся) нецелевые эффекты, мы также хотели подтвердить синергию между ингибированием Src и нарушением SAC на генетическом уровне.Для этого мы разработали три индуцируемых конструкции shRNA для Src, одна из которых (shRNA3) приводила к значительному нокдауну уровней белка Src в клетках RPE1 (нокдаун 54%, рис. S3N). Действительно, мы обнаружили, что клетки RPE1 Src cKD были гораздо более чувствительны к ингибитору SAC реверсину, чем клетки RPE1 дикого типа (рис. 4I), особенно во второй половине эксперимента (4-7 дни), аналогично наблюдаемому для Клетки Mad2 cKD , обработанные SKI606 (сравните фиг. 4H с 4I). Таким образом, мы делаем вывод, что фармацевтическое и генетическое ингибирование Src избирательно токсично для клеток с нарушенным SAC.

Синергизм между ингибированием Mad2 и Src не связан с нарушением передачи сигналов о повреждении ДНК

Src является онкогеном, ключевым регулятором выживания клеток и митоза (Thomas & Brugge, 1997), активатором DNA-PK (Dittmann et al, 2008), регулятор организации актина (Destaing et al, 2008) и ориентации веретена (Nakayama et al, 2012). Поэтому мы затем спросили, каков механизм наблюдаемого синергизма ингибирования SAC и Src в предотвращении пролиферации клеток.Поскольку CIN приводит к повреждению ДНК (Janssen et al, 2011), а Src участвует в активации ответа на повреждение ДНК посредством активации ДНК-ПК (Dittmann et al, 2008), мы затем спросили, будет ли ингибирование ДНК-ПК воспроизводить результаты, наблюдаемые с Src ингибирование. Для этого мы подвергли клетки воздействию ингибитора ДНК-ПК в концентрации, которая значительно увеличивала очаги γ-h3AX после гамма-излучения, что указывает на нарушение репарации ДНК (рис. S4A). В этом случае мы обнаружили, что ингибирование ДНК-ПК не было синергически токсичным в клетках Mad2 cKD , обработанных доксом (рис. S4B).В соответствии с этим другой ингибитор ДНК-ПК, который был включен в наш скрининг (соединение № 1463; NU7441), не проявлял дифференциального эффекта между контрольными клетками и клетками CIN RPE1. Наконец, мы обнаружили, что 4 Грэй облучения и SKI606 снижали пролиферацию клеток RPE1, как и ожидалось, но SKI606 не ингибировал рост облученных клеток больше, чем в контроле, что указывает на то, что ингибирование роста, вызванное SKI606, не зависит от повреждения ДНК. Рис. S4C). Поэтому мы заключаем, что наблюдаемая синергия между ингибированием Mad2 и Src не вызвана усилением повреждения ДНК.

Рисунок S4. Повреждение ДНК не является синергически токсичным при ингибировании Src в клетках Mad2 cKD RPE1.

(A) Двухцепочечные разрывы ДНК, оцененные с помощью мечения γh3AX в контроле и облученных (4 Грэй, 15 ч после облучения) клетках RPE1 с 250 нМ ингибитора ДНК-ПК KU0060648 или без него. Каждая категория включает минимум 100 ячеек. P — значения, оцененные критерием хи-квадрат. (B) Кривая роста контроля и клеток Mad2 cKD RPE1 с или без 250 нМ KU0060648.Данные были получены с помощью последовательных ежедневных микроскопических изображений и проанализированы с помощью FIJI-PHANTAST. Данные включают три технические повторности. Столбики погрешностей относятся к SEM. P — значение рассчитывается для AUC по отношению к контрольной клеточной линии с использованием двустороннего теста t . (C) Пролиферация оценивалась путем окрашивания клеток RPE1 кристаллическим фиолетовым через 48 ч после облучения 0, 1, 2 или 4 Грея с дозой 0,5 мкМ или без нее 1,407. Все данные были получены в трехкратной технической повторности и скорректированы с учетом только радиационного контроля. Значение P оценивали с использованием двустороннего теста t .

SKI606 увеличивает CIN в SAC-дефицитных клетках путем дерегулирования скорости полимеризации МТ

Поскольку SKI606, по-видимому, не нацелен на стрессы, вызванные анеуплоидией, или повреждение ДНК, мы затем исследовали, влияет ли SKI606 на скорость неправильной сегрегации хромосом. Для этого мы провели эксперименты с покадровой визуализацией контрольных клеток и клеток Mad2 cKD RPE1, экспрессирующих h3B-GFP, и количественно оценили митотические аномалии в присутствии или отсутствии SKI606.Интересно, что мы обнаружили, что, хотя SKI606 не увеличивал CIN в контрольных клетках, он значительно увеличивал CIN в клетках Mad2 cKD (рис. 5A), увеличивая скорость неправильной сегрегации с 46 до 79%.

Рисунок 5. 1,407 значительно увеличивает CIN в клетках с дефицитом контрольной точки сборки веретена (SAC) за счет изменения динамики микротрубочек (MT).

(A, B, C) Частота митотических аномалий в контроле и Mad2 cKD Клетки RPE1 с 0,5 мкМ соединения № 1407 и без него (A), клетки RPE1 с 150 нМ реверсина с 0 и без него.5 мкМ соединения № 1407 (B) и клетки MCF7, обработанные 15 нМ реверсина и/или 0,5 мкМ соединения № 1407 (C). Данные были получены с помощью цейтраферной микроскопии и включают не менее трех биологических повторов. P — значения рассчитываются по критерию хи-квадрат. (D) Количественное определение времени от начала профазы до поздней метафазы для контроля и клеток Mad2 cKD RPE1 с 0,5 мкМ соединения № 1407 и без него. По крайней мере, 29 митозов были проанализированы для каждого условия как минимум из трех экспериментов с цейтраферной микроскопией. (E) Коробчатая диаграмма, показывающая среднюю скорость миграции клеток (мкм/с) клеток RPE1 с 0,5 мкМ или без него 1,407. Данные включают как минимум три независимых эксперимента по визуализации. P — значения рассчитываются с использованием теста Уилкокса. (F) МТ плюс конечная скорость роста в митозе с 0,5 мкМ соединения #1407 и без него. Каждая точка представляет собой среднее значение 20 перемещений MT в ячейке, по 20 ячеек на состояние. (G) Кривые роста на основе IncuCyte для контроля и Mad2 cKD RPE1 в присутствии или в отсутствие 33 нМ нокодазола на 8-16 дни.На график наносят AUC относительно контрольных клеточных линий, значения P рассчитывают с использованием критерия Уилкоксона-Манна-Уитни. Данные для контрольных кривых ДМСО также использованы на рис. 4G и H. (H) Частота митотических аномалий в клетках RPE1 с 0,5 мкМ соединения #1407 или без него и/или 33 нМ нокодазола. Данные были получены с помощью цейтраферной микроскопии и включают не менее трех биологических повторов. P — значения рассчитываются методом хи-квадрат. «n» относится к количеству митотических событий на состояние.« # » означает, что те же данные используются и на рис. 2E.

В качестве параллельного подхода мы уменьшили SAC с помощью реверсина в клетках RPE1, как это было сделано для клеток Src cKD (рис. 4I), и обнаружили, что SKI606 действительно специфически увеличивает скорость неправильной сегрегации хромосом в клетках, обработанных реверсином (рис. 5B). Мы также обнаружили, что этот фенотип сохраняется в других клеточных линиях. Например, SKI606 увеличивал частоту CIN обработанных реверсином клеток рака молочной железы MCF7 с 30 до 46%, тогда как SKI606 не изменял скорость CIN клеток MCF7 (17–19%) в отсутствие реверсина (рис. 5C).Вместе эти наблюдения предполагают, что ингибирование Src усугубляет фенотип CIN, особенно в клетках с нарушенным SAC.

Для дальнейшего изучения механизма, лежащего в основе эффектов SKI606 на сегрегацию хромосом, мы определили, влияет ли ингибирование Src на время митоза. Для этого мы сравнили митотическую длину между контролем и клетками Mad2 cKD RPE1 с ингибированием Src и без него. Хотя ослабление Mad2 уменьшало время от профазы до метафазы, как наблюдалось ранее (Meraldi et al, 2004), митотическая длина снова увеличивалась, когда клетки Mad2 cKD RPE1 подвергались воздействию SKI606 (рис. 5D).Это предполагает, что повышенная скорость неправильной сегрегации хромосом в клетках Mad2 cKD , обработанных SKI606, не была вызвана дальнейшим ингибированием SAC и, следовательно, может быть результатом измененной динамики MT. Время митоза контрольных клеток RPE1 не влияло на обработку SKI606, что соответствует отсутствию фенотипа CIN в контрольных клетках RPE1, обработанных SKI606. Кроме того, при анализе данных замедленной съемки мы также отметили, что клетки, обработанные SKI606 (клетки RPE1 [рис. 5E] и клетки MCF7 [рис. S5A]), демонстрировали сниженную подвижность клеток, что также свидетельствует о влиянии SKI606 на динамику МТ.

Рисунок S5. Ингибирование Src приводит к увеличению скорости полимеризации МТ.

(A) Средняя скорость движения клеток (мкм/с) клеток MCF7 с 0,5 мкМ SKI606 или без него. Данные включают как минимум три независимых эксперимента по визуализации. P -значения рассчитываются с помощью U-критерия Уилкоксона-Манна. (B) Частота митотических аномалий, наблюдаемых в клетках HT29, инкубированных с 150 нМ реверсина и/или 0,5 мкМ SKI606 или без них. Данные включают как минимум три независимых эксперимента с покадровой визуализацией и минимум 90 митотических событий для каждого состояния. Значение P было рассчитано по критерию хи-квадрат. (C) Кривые роста, полученные с помощью IncuCyte (день 1–7) контрольных клеток и клеток Mad2 cKD RPE1 с 10 нг/мл нокодазола или без него. Данные включают по шесть повторов каждый. Значение P рассчитывали из двустороннего теста t на AUC относительно контрольной клеточной линии. Данные для контрольных кривых ДМСО представлены на рис. S3L и M. (D) . Полученные IncuCyte кривые роста клеток HT29 с 150 нМ реверсина и/или 0 или без него.5 мкМ SKI606. Данные включают шесть повторов для каждого условия. Значение P рассчитывали из одностороннего теста t AUC относительно контроля клеточной линии.

Учитывая наши результаты и известную роль Src в ориентации веретена (Nakayama et al, 2012) и зарождении МТ (Colello et al, 2010), мы затем исследовали влияние SKI606 на динамику МТ в ряде CIN и не- CIN (раковые) клеточные линии. Для этого мы количественно оценили динамику МТ с помощью покадровой визуализации в контрольных и обработанных SKI606 клетках, экспрессирующих EB3-GFP, который маркирует плюс-концы МТ и, следовательно, может использоваться для количественной оценки динамики МТ (Степанова и др., 2003).Используя этот подход, мы обнаружили, что SKI606 значительно увеличивает скорость полимеризации МТ в RPE1, а также в диплоидных, не-CIN HCT116 раковых клетках. Интересно, что мы обнаружили, что SKI606 увеличивает скорость полимеризации МТ в этих клеточных линиях без CIN до скоростей, сравнимых со скоростями, наблюдаемыми в линиях раковых клеток CIN SW620 и HT29 (рис. 5F и видео 1–8). Однако обработка SKI606 не привела к дальнейшему увеличению скорости полимеризации МТ в клетках HT29 и оказала лишь незначительное влияние на скорость полимеризации МТ в клетках SW620, предполагая, что скорость полимеризации МТ достигла своего физиологического максимума в этих линиях (рис. 5F и видео 1–8). ).Подобно тому, как это наблюдалось для клеток RPE1 и MCF7, мы обнаружили, что обработка SKI606 не увеличивала скорость неправильной сегрегации хромосом в клетках HT29, обработанных ДМСО (рис. S5B). Однако, в то время как обработка реверсином умеренно увеличивала скорость CIN в клетках HT29, как и ожидалось, комбинированная обработка SKI606 и реверсином не смогла дополнительно увеличить скорость CIN в клетках HT29 (рис. S5B), что является дополнительным доказательством того, что SKI606 действует путем дерегулирования скорости полимеризации MT. Учитывая эти результаты, а также поскольку ранее было показано, что повышенная скорость полимеризации MT управляет фенотипами CIN (Ertych et al, 2014), мы делаем вывод, что SKI606 вносит вклад в фенотип CIN, изменяя скорость полимеризации MT.

Видео 1 Клетки

RPE1, экспрессирующие EB3-GFP, для отслеживания скорости полимеризации МТ, количественно представленной на рис. 5F. Обратите внимание, что это максимальные проекции и что отдельные z-стеки использовались для анализа скорости полимеризации. Необработанные данные доступны по запросу. Скачать видео

Видео 2

Клетки RPE1, экспрессирующие EB3-GFP, обработанные SKI606 для отслеживания скорости полимеризации МТ, количественно представленной на рис. 5F. Обратите внимание, что это максимальные проекции и что отдельные z-стеки использовались для анализа скорости полимеризации.Необработанные данные доступны по запросу. Загрузить видео

Видео 3 Клетки

HCT116, экспрессирующие EB3-GFP, для отслеживания скорости полимеризации МТ, количественно представленной на рис. 5F. Обратите внимание, что это максимальные проекции и что отдельные z-стеки использовались для анализа скорости полимеризации. Необработанные данные доступны по запросу. Загрузить видео

Видео 4 Клетки

HCT116, экспрессирующие EB3-GFP, обработанные SKI606 для отслеживания скорости полимеризации МТ, количественно представленной на рис. 5F. Обратите внимание, что это максимальные проекции и что отдельные z-стеки использовались для анализа скорости полимеризации.Необработанные данные доступны по запросу. Загрузить видео

Видео 5

Клетки HT29, экспрессирующие EB3-GFP, для отслеживания скорости полимеризации МТ, количественно представленной на рис. 5F. Обратите внимание, что это максимальные проекции и что отдельные z-стеки использовались для анализа скорости полимеризации. Необработанные данные доступны по запросу. Загрузить видео

Видео 6 Клетки

HT29, экспрессирующие EB3-GFP, обработанные SKI606 для отслеживания скорости полимеризации МТ, количественно представленной на рис. 5F. Обратите внимание, что это максимальные проекции и что отдельные z-стеки использовались для анализа скорости полимеризации.Необработанные данные доступны по запросу. Загрузить видео

Видео 7 Клетки

SW620, экспрессирующие EB3-GFP, для отслеживания скорости полимеризации МТ, количественно представленной на рис. 5F. Обратите внимание, что это максимальные проекции и что отдельные z-стеки использовались для анализа скорости полимеризации. Необработанные данные доступны по запросу. Скачать видео

Видео 8 Клетки

SW620, экспрессирующие EB3-GFP, обработанные SKI606 для отслеживания скорости полимеризации МТ, количественно представленной на рис. 5F. Обратите внимание, что это максимальные проекции и что отдельные z-стеки использовались для анализа скорости полимеризации.Необработанные данные доступны по запросу. Загрузить видео

Изменение динамики МТ синергетически токсично с ингибированием SAC

Чтобы определить, является ли синергизм между изменением динамики МТ и ингибированием SAC специфичным для SKI606 или применим к другим ядам МТ, мы затем протестировали эффект уменьшения SAC с помощью низких доз нокодазола, которые не вызывают SAC, а только вызывают увеличение скорости полимеризации МТ (Ertych et al, 2014). Для этого мы сначала определили нетоксичную концентрацию при длительном (до 8 дней) лечении нокодазолом.В то время как 250, 100, 50 и 25 нг/мл нокодазола полностью ингибировали пролиферацию в этих условиях, 10 нг/мл (33 нМ) нокодазола были совместимы с клеточным делением. Действительно, хотя 33 нМ нокодазола по-прежнему снижали пролиферацию контрольных клеток RPE1, он был значительно более токсичен для клеток Mad2 cKD RPE1, что подтверждает синтетическую летальность между ингибированием SAC и нарушением регуляции скорости полимеризации МТ (рис. 5G и S5C, на 13% больше, чем при аддитивном действии). эффект, P = 7.0E-3, тест на независимость Блисса).Также в этих условиях наблюдаемый синергизм между низкими дозами нокодазола и ингибированием SAC совпал с увеличением частоты неправильной сегрегации хромосом: в то время как 33 нМ нокодазола вызывали митотические аномалии только в 6% контрольных клеток RPE1, 83% обработанных нокодазолом клеток Mad2 cKD RPE1 страдали от дефектных митозов, по сравнению с 31% в отсутствие нокодазола (рис. 5H). Наконец, когда мы объединили SKI606 с ослаблением SAC в клеточной линии CIN HT29, в которой скорость полимеризации МТ не может быть дополнительно увеличена (рис. 5F [Ertych et al, 2014]), мы обнаружили, что ингибирование Src, вызванное SKI606, больше не действовало синергетически. с уменьшением SAC в снижении количества клеток (рис. S5D), что еще раз указывает на то, что измененная динамика MT лежит в основе синергии, наблюдаемой между SKI606 и ингибированием SAC.Мы пришли к выводу, что изменение скорости полимеризации MT синергизирует с ингибированием SAC в блокировании пролиферации клеток, тем самым открывая новые терапевтические возможности для рака, при которых нарушена динамика SAC или MT.

Обсуждение

CIN и возникающая в результате анеуплоидия являются отличительными признаками раковых клеток. Поскольку оба признака отличают раковые клетки от здоровых, они являются многообещающими терапевтическими мишенями. В этом исследовании мы исследовали, проявляют ли клетки с CIN или стабильной анеуплоидией избирательную уязвимость к определенным лекарствам.Поскольку CIN и анеуплоидия вызывают ряд реакций в клетках, включая, помимо прочего, протеотоксический стресс (Oromendia et al, 2012; Stingele et al, 2012), нарушение регуляции клеточного метаболизма (Williams et al, 2008; Tang et al, 2011). ), реакцию на повреждение ДНК (Zhang et al, 2015; MacKenzie et al, 2017), старение (Andriani et al, 2016) и апоптоз (Ohashi et al, 2015), мы выбрали небольшую библиотеку Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов. одобренные препараты или соединения в клинических испытаниях, направленные на ответы, связанные с анеуплоидией/CIN.

Анеуплоидные клетки чувствительны к соединениям, которые гиперактивируют клеточный метаболизм

Когда мы провели скрининг соединений, которые избирательно предотвращают размножение анеуплоидных клеток, мы обнаружили, что ZLN005, транскрипционный стимулятор PGC-1α, был значительно более токсичен для двойной трисомии RPE1 Клетки Ts12 Ts5 (Stingele et al, 2012), чем контрольные клетки. PGC-1α является основным регулятором митохондриального биогенеза и энергетического метаболизма, поэтому ожидается, что его активация усилит митохондриальное дыхание.Ни одно из других испытанных соединений не показало воспроизводимой токсичности, характерной для анеуплоидных клеток. Хотя это несколько разочаровывает, важно отметить, что мы протестировали только ограниченное количество соединений (всего 95) в этом скрининге и что крупномасштабные скрининги в будущем могут выявить новые терапевтические уязвимости анеуплоидных клеток. Тем не менее, наши результаты в анеуплоидных клетках хорошо согласуются с более ранним исследованием Tang et al (2011), которые идентифицировали вызывающий энергетический стресс препарат AICAR как соединение, которое избирательно нацелено на анеуплоидные клетки.AICAR активирует AMP-активированную протеинкиназу (AMPK), что приводит к гиперактивации митохондриального дыхания и, таким образом, усугубляет метаболический стресс (Tang et al, 2011). Интересно, что AMPK действует как активатор PGC-1α (Jeon, 2016; Tan et al, 2016), и поэтому ожидается, что активация AMPK через AICAR будет фенокопировать активацию PGC-1α через ZLN005, что мы и обнаружили. Таким образом, наши результаты представляют собой важное независимое подтверждение этих более ранних результатов, и хотя наши результаты необходимо подтвердить на анеуплоидных клеточных линиях с другими кариотипами, чтобы исключить специфические эффекты кариотипа, они требуют дальнейших исследований молекулярного механизма, лежащего в основе этой чувствительности.

Примечательно, что ZLN005 не появился как соединение, избирательно воздействующее на клетки с продолжающимся фенотипом CIN (клетки Mad2 cKD RPE1; рис. S3K), хотя было показано, что фенотип CIN в этих клетках приводит к значительной анеуплоидии (рис. 2G). Возможно, анеуплоидным клеткам необходимо адаптироваться к анеуплоидному состоянию, прежде чем они станут чувствительными к препаратам, усугубляющим клеточный метаболизм (клетки Mad2 cKD RPE1 подвергались воздействию фенотипа CIN только в течение 12 дней). В качестве альтернативы, поскольку продолжающаяся CIN и анеуплоидия вызывают (частично) разные реакции в клетках (Bakker et al, 2018 Preprint ), они также могут проявлять дифференциальную уязвимость.

Синтетическое летальное взаимодействие между ингибированием SAC и активностью Src

В дополнение к скринингу соединений, которые избирательно предотвращают накопление анеуплоидных клеток, мы также проводили скрининг соединений, которые избирательно нацеливаются на клетки с фенотипом CIN. Для последнего мы разработали клетки RPE1, в которых мы могли облегчить SAC индуцируемым образом (клетки Mad2 cKD RPE1). Этот скрининг идентифицировал SKI606, ингибитор Src, как соединение, которое избирательно нарушает накопление клеток с облегчением SAC.Важно отметить, что мы подтвердили фенотип с другим ингибитором Src и подтвердили, что эффект ингибиторов вызван ингибированием Src, потому что генетическое нарушение Src с помощью shRNA с ингибированием SAC приводит к тому же фенотипу, что и обработка ингибитором с ингибированием SAC. Следует отметить, что нам удалось снизить уровни белка Src только примерно в два раза с использованием shRNA и не удалось сконструировать клеточные линии с нокаутом Src с использованием технологии CRISPR (данные не показаны), что предполагает, что клетки критически полагаются на некоторую оставшуюся активность киназы Src для их выживания.Таким образом, чтобы фенокопировать селективное нацеливание на клетки CIN in vivo в будущих исследованиях, будет важно хорошо титровать концентрации лекарств.

Мы обнаружили, что ингибирование Src увеличивает скорость неправильной сегрегации хромосом, особенно в клетках с нарушенной митотической контрольной точкой. Хотя Src, насколько нам известно, непосредственно не участвует в поддержании митотической точности, было показано, что он способствует зарождению и повторному росту МТ (Colello et al, 2010) путем связывания с комплексами γ-tubulin (Kukharskyy et al, 2004).Кроме того, было обнаружено, что Src способствует ориентации веретена (Nakayama et al, 2012), а онкогенный v-Src ассоциирован с нарушением цитокинеза (Nakayama et al, 2017). Это исследование показало, что ингибирование Src приводит к увеличению скорости полимеризации MT, что усугубляет фенотип CIN, вызванный потерей Mad2. Интересно, что хотя было обнаружено, что несколько ингибиторов Src влияют на полимеризацию тубулина, это обычно обозначали как «двойной механизм действия», а не как последующий эффект ингибирования Src (Liu et al, 2013; Smolinski et al, 2018).Наше исследование предполагает, что повышенная скорость полимеризации МТ является прямым следствием ингибирования Src и что, следовательно, эти эффекты следует учитывать при лечении пациентов с ингибиторами Src.

Механизм, лежащий в основе синтетического летального взаимодействия между ослаблением SAC и ингибированием Src

Чем можно объяснить синергизм между ослаблением SAC и ингибированием Src в уничтожении клеток? Наши данные показывают, что ингибирование Src приводит к увеличению скорости полимеризации МТ.Важно отметить, что мы показываем, что другие препараты, дестабилизирующие MT, демонстрируют такое же летальное взаимодействие с ингибированием SAC, что еще раз подтверждает нашу гипотезу о том, что синтетическое летальное взаимодействие между SAC и ингибированием Src объясняется ролью, которую Src играет в регулировании скорости полимеризации MT. Но почему SAC-дефицитные клетки особенно уязвимы к дерегулированной динамике MT и почему ингибирование Src даже не навязывает умеренный фенотип CIN контрольным клеткам RPE1? Когда скорость полимеризации МТ увеличивается в клетках с полностью функциональным SAC, это приводит к снижению подвижности клеток и повышению стабильности кинетохор-МТ и, таким образом, к гиперстабильным взаимодействиям кинетохор-МТ.В этих условиях SAC по-прежнему будет задерживать митоз до тех пор, пока не будут устранены все хромосомные аномалии, вызванные ингибированием Src. Однако, когда SAC также ингибируется, он больше не может разрешать гиперстабильные взаимодействия кинетохора-MT, вызванные ингибированием Src, тем самым еще больше увеличивая частоту событий неправильной сегрегации хромосом (Fig 6).

Рисунок 6. Предполагаемый механизм того, как повышенная динамика МТ и ингибирование SAC приводят к синергетической токсичности, усугубляя фенотип CIN.

(A) Клетки с нормальной динамикой тубулина и функциональным SAC имеют очень низкий уровень неправильной сегрегации хромосом. (B) Клетки с нормальной динамикой тубулина, но с ослабленным SAC демонстрируют промежуточную неправильную сегрегацию хромосом. (C) Клетки с высокой динамикой тубулина, но функционирующим SAC исправляют неприкрепленные кинетохоры перед вступлением в анафазу. (D) Клетки с повышенной динамикой МТ и ослабленным SAC страдают от повышенного количества невыровненных хромосом, которые не сигнализируются SAC, что приводит к увеличению частоты неправильной сегрегации хромосом.

Хотя в этом исследовании мы показали, что ингибирование Src снижает верность митоза именно в клетках с ингибированной контрольной точкой веретена, мы не исследовали дальнейшие последствия возникающего в результате увеличения частоты CIN.Вполне вероятно, что дефекты роста, которые мы наблюдали после комбинированного ингибирования Src и SAC, вызваны комбинацией остановки клеточного цикла и гибели клеток (недавний обзор по этой теме см. в Chunduri & Storchová (2019)). подвергаются апоптозу, зависит от кариотипов, которые анеуплоидные клетки приобрели после CIN-инсульта. Поскольку последствия CIN могут быть в высокой степени тканеспецифичными (Foijer et al, 2013, 2017), будет важно дополнительно изучить последующие последствия изменения динамики МТ в сочетании с ингибированием контрольной точки веретена в клеточных и органоидных культурах, а также на животных моделях перед передача этих данных в клинику.

Значение для терапии рака

CIN и анеуплоидия являются отличительными признаками раковых клеток, поражающих примерно 70% всех солидных раков (Duijf et al, 2013). Следовательно, методы лечения, использующие эту функцию, могут иметь широкое применение. Наше исследование предполагает, что обострение CIN в клетках с ранее существовавшим фенотипом CIN является мощной стратегией для избирательного нацеливания на клетки CIN. Действительно, о том, что увеличение CIN является мощным методом борьбы с нестабильным раком генома, сообщалось и другими (Kops et al, 2004; Thompson et al, 2010; Silk et al, 2013; Zasadil et al, 2016).Одно из возможных объяснений этого заключается в том, что раковые клетки переносят низкие уровни CIN до тех пор, пока уровень CIN не превысит пороговое значение, после чего он становится слишком токсичным для выживания клеток. Наши результаты показывают, что изменение динамики МТ до уровня, не влияющего на верность митоза, уже может действовать синергетически с дефектами или ингибиторами SAC. Это особенно актуально для рака, при котором скорость полимеризации SAC или MT в некоторой степени затрагивается, поскольку дефект в одном процессе делает раковые клетки чрезвычайно чувствительными к вмешательству в другой процесс, что делает терапию гораздо более специфичной для данного заболевания. раковых клеток и, таким образом, уменьшить побочные эффекты и долгосрочную токсичность лечения.

В качестве альтернативы синтетическое летальное взаимодействие можно использовать для нацеливания на делящиеся раковые клетки в комбинированной терапии с использованием обоих препаратов в гораздо более низких концентрациях, чем при использовании препаратов по отдельности. Действительно, другие также сообщили, что ингибиторы SAC действуют синергически с таксанами при уничтожении клеток в культуре тканей (Janssen et al, 2009; Jemaà et al, 2013; J Tannous et al, 2013; Bargiela-Iparraguirre et al, 2014; Maia et al. , 2018) и в исследованиях на мышах in vivo (Jemaà et al, 2013; Tannous et al, 2013; Maia et al, 2015, 2018; Wengner et al, 2016).Было показано, что наблюдаемый синергизм является результатом увеличения CIN (Thompson & Compton, 2008; Janssen et al, 2009). Фактически, в настоящее время продолжаются три клинических испытания (NCT03328494, NCT02366949 и NCT03411161), в которых ингибиторы Mps1 сочетаются с паклитакселом для лечения рака человека (Bayer, 2015; Boston-Pharmaceuticals, 2017; Servier, 2018). В этом исследовании мы показываем, что эта синергия не ограничивается Mps1 и таксанами, и что альтернативные подходы к изменению динамики МТ (такие как препараты, дестабилизирующие МТ, такие как винкристин или ингибиторы Src) в сочетании с ингибированием SAC могут быть использованы для синергетического воздействия. клетки CIN за счет значительного увеличения CIN.Однако, прежде чем наши результаты можно будет использовать в клинике, необходимы дальнейшие проверочные эксперименты, которые должны показать, являются ли ингибиторы Src столь же эффективными, как и другие препараты, дерегулирующие полимеризацию МТ, и действительно ли такие препараты действуют синергетически с ингибиторами SAC при нацеливании на раковые клетки in vivo.

Материалы и методы

Культура клеток и соединения

Клетки RPE1 и MCF7 (Американская коллекция типовых культур) выращивали в среде DMEM с добавлением 10% FBS и 100 единиц/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.Клетки HT29 выращивали в среде McCoy с добавлением 10% FBS и Pen/Strep, как указано выше. Анеуплоидные клетки RPE1 с трисомией 12 и трисомией 5 (Ts12 Ts5) и клетки RPE1 hTert были любезно предоставлены лабораторией Storchova (Stingele et al, 2012). Большинство препаратов, использованных в этом исследовании, были синтезированы Syncom B.V., за исключением AZD8055 (Sigma-Aldrich), EPZ015666 (Sigma-Aldrich) и SKI-1 (Abcam). Все лекарственные средства растворяли в ДМСО (Sigma-Aldrich) и разбавляли в среде для тканевых культур, как указано. Используемые концентрации лекарственного средства титровали перед фактическим скринингом, начиная с начальной концентрации лекарственного средства 10 мкМ.Если начальная концентрация препарата 10 мкМ была (почти) токсичной для клеток RPE1 дикого типа, клетки затем подвергали воздействию 1 мкМ, 0,1 мкМ, 10 нМ или 1 нМ соединения до тех пор, пока не была обнаружена концентрация, больше не токсичен (см. Дополнительные данные 3 для всех начальных кривых роста титрования препарата).

Дополнительные данные 3.

Кривые титрования препаратов, используемые для определения исходных концентраций препаратов для скрининга анеуплоидии и CIN, как описано в разделе «Материалы и методы». [LSA-2019-00499_Supplemental_Data_3.pdf]

Генерация клеток Mad2

cKD и Src cKD RPE1

Клетки Mad2 cKD RPE1 были получены путем трансдукции клеток RPE1 лентивирусной конструкцией, нацеленной на Mad2l1 человека (5′-GGAAAGAATCAAGGAGGGGGGGGG). основу (Open Biosystems, кат. номер RHS4696-200677332). Клетки отбирали в 2 мкг/мл пуромицина в течение 48 ч и отбирали одноклеточные клоны. Эффективность нокдауна определяли для нескольких клонов с помощью вестерн-блоттинга, и клон с наибольшей редукцией Mad2 использовали для дальнейших экспериментов.Клетки RPE Src cKD получали путем трансдукции конструкций лентивирусной кшРНК в клетки RPE1 дикого типа. Для этой цели конструкции Src shRNA встраивают в doxycycline-индуцируемую основу pLKO, которая также содержит последовательность оператора Tet, позволяющую условно активировать shRNA (Wiederschain et al, 2009). В этом векторе мы заменили ген устойчивости к пуромицину на ген устойчивости к бластицидину. В полученном векторе Tet-pLKO-Blas мы клонировали следующие последовательности кшРНК, нацеливающие на Src, используя двухцепочечные олигонуклеотиды, заказанные в Integrated DNA Technologies (IDT): кшРНК2: 5′-CCGGTCAGAGCGGTTACTGCTCAATCTCGAGATTGAGCAGTAACCGCTCTGATTTTTG-3′

  • кшРНК3: 5′-CCGGGACAGACCTGTCCTTCAAGAACTCGAGTTTCTTGAAGGACAGGTCTGTCTTTTTG-3′.

  • Вестерн-блоттинг

    Клетки собирали во время логарифмической фазы роста и лизировали в буфере для лизиса яиц (150 мМ NaCl, 50 мМ Hepes, pH 7,5, 5 мМ ЭДТА и 0,1% NP-40). Количественное определение белка проводили с использованием анализа Quick Start Bradford, стандартного набора Quick Start BSA (Bio-Rad Inc.) или MultiScan Go (Thermo Fisher Scientific). В качестве антител использовали актин (#4970; Cell Signaling Technologies), тубулин (#ab7291; Abcam), Src (#2109; Cell Signaling Technologies) и Mad2 (#610678; BD Bioscience).Вторичными антителами были антимышиные IRDye 680RD (ab216778; Abcam) и антикроличьи IRDye 800CW (ab216773; Abcam). Блоты визуализировали и количественно определяли с использованием системы визуализации Odyssey (Li-Cor).

    Секвенирование одиночных клеток

    Для секвенирования одиночных клеток клетки собирали, выделяли ядра и окрашивали Hoechst с использованием буфера для выделения ядер. Затем отдельные ядра сортировали в 96-луночные планшеты с использованием сортировщика FACSJazz (BD Bioscience). Библиотеки ДНК одиночных клеток были подготовлены и секвенированы (NextSeq 500; Illumina) с покрытием геномной ДНК ~1%, как описано ранее (van den Bos et al, 2016).Файлы карт Sequence Binary Alignment были проанализированы с помощью AneuFinder версии 1.10.2 с использованием модели анализа eDivisive размером 1 МБ, как описано в другом месте (Bakker et al, 2016). Файлы карт Sequence Binary Alignment и R-скрипт, используемые для анализа, доступны по запросу. Данные секвенирования отдельных клеток депонированы в Европейском архиве нуклеотидов под номером доступа PRJEB33217.

    Метафазные спреды

    Клетки культивировали с 100 нг/мл колцемида в течение 3 ч, собирали, инкубировали в 75 мМ KCl в течение 15 мин и фиксировали в смеси метанол:уксусная кислота, 3:1.Фиксированные клетки помещали на предметные стекла, и ядра визуализировали с помощью окрашивания DAPI. Фигуры метафаз просматривали на микроскопе Olympus BX43 с объективом 63×. На одно состояние подсчитывали минимум 50 кариотипирующих спредов.

    Кривые роста IncuCyte

    Для скрининга анеуплоидных препаратов по 200 клеток RPE1 сортировали в каждую лунку 96-луночного планшета с помощью проточной цитометрии (FACSJazz; BD Bioscience). Для скрининга CIN и последующих скринингов 1600 клеток высевали на лунку 96-луночного планшета.В последнем случае клетки RPE1 Mad2 cKD обрабатывали 1 мкг/мл доксициклина в течение как минимум 3 дней до начала любого скрининга и сортировали в лунки с 1 мкг/мл доксициклина. Каждая лунка содержала среды с лекарственными средствами в указанных концентрациях, и все измерения проводились с техническими повторами для каждого планшета. Рост клеток контролировали каждые 2 часа с помощью системы анализа живых клеток IncuCyte Zoom (Essen BioScience Ltd.). Среду, содержащую лекарство, обновляли каждые 4 дня, а для скрининга CIN клетки пассировали в соотношении 1:8 на 4-й день.Плотность клеток определяли количественно с помощью программного обеспечения IncuCyte ZOOM 2018A. Слияние контрольных клеток и клеток CIN с лекарственными средствами нормализовали к клеткам, обработанным ДМСО (клетки RPE1 + DMSO и Mad2 cKD RPE + DMSO, соответственно) и рассчитывали с использованием двух разных подходов: AUC и анализа наклона. Что касается скрининга, тестировали несколько лекарств на чашке, использовали один и тот же контроль ДМСО (по крайней мере, один на чашку) для сравнения эффектов клеток, обработанных лекарством. Подписи к рисункам указывают, на каких панелях использовали один и тот же контроль ДМСО.

    Кривые роста IncuCyte AUC

    AUC рассчитывали, взяв сумму слияний в момент времени. Затем эти значения устанавливали относительно контрольной AUC каждой отдельной клеточной линии. Для этого каждое значение AUC делили на среднее значение AUC контрольной клеточной линии, то есть контроль RPE1, двойную трисомию RPE1 (Ts12 Ts5) и клетки RPE1 Mad2 cKD анализировали как разные клеточные линии, так что относительный эффект каждое возмущение можно было сравнить для каждого типа клеток. Эти относительные значения AUC затем сравнивали между клеточными линиями на лекарство с использованием двустороннего теста t . P -значения на экране были скорректированы для многократного тестирования с использованием поправки Бонферрони (Haynes, 2013).

    Анализ наклона

    Существующий скрипт R для анализа данных IncuCyte (Chapman et al, 2016) был изменен, чтобы найти точку отсечки для логарифмического роста. Для каждой комбинации лекарственного средства и клеточной линии определяли логарифмическую точку отсечки роста, а слияние в точке отсечки брали и делили на среднюю сплоченность контрольной клеточной линии. Поскольку наклон определяется как высота (конфлюэнтность), деленная на ширину (время отсечки), а точка отсчета времени была установлена ​​одинаковой для всех пар ДМСО и лекарственного средства, точки отсчета времени компенсируются при установке относительного наклона. к контролю клеточной линии.Полученные значения относительного наклона сравнивали между клеточными линиями для каждого типа лекарственного средства с использованием теста t . Модифицированный пакет IncucyteDRC R для анализа наклона экрана доступен по запросу.

    Независимый тест Блисса на синергетическую токсичность между препаратами

    Чтобы подтвердить, что наблюдаемые эффекты при скрининге соединений были синергетическими, а не только аддитивными, мы использовали тест независимости Блисса. Для этого мы рассчитали фракционное ингибирование роста, определяемое как 1-(AUC обработанных лекарственным средством клеток /AUC контрольных клеток ).Затем мы рассчитали ожидаемое ингибирование, предполагая, что препараты и CIN/анеуплоидные условия являются аддитивными, используя уравнение независимости Блисса: ожидаемое ингибирование = Fa + Fb — (Fa*Fb), где Fa — фракционное ингибирование роста препарата А, а Fb — фракционное ингибирование роста CIN или анеуплоидных клеток. Ожидаемое ингибирование сравнивали с фактическим ингибированием роста; значение P определяли с использованием теста t , а токсичность выше аддитивной определяли, взяв разницу между ожидаемым и фактическим фракционным ингибированием.

    Кривые роста, проанализированные FIJI PHANTAST

    Для проверочных экспериментов кривые роста были определены из ежедневных микроскопических изображений с использованием микроскопа Olympus IX51. Для этих экспериментов 5300 клеток высевали на лунку 24-луночного планшета. Каждую лунку визуализировали один раз в день в течение как минимум 7 дней. Пакет FIJI PHANTAST (Jaccard et al, 2014) использовался для оценки слияния на лунку в определенный момент времени. Настройки PHANTAST: ε = 5 и σ в диапазоне от 0,01 до 0,03 в зависимости от покрытия ячеек и точности слияния.Все измерения включают как минимум три технических повтора и три биологических повтора (т. е. минимум девять измерений на момент времени). Рост строили с помощью программного обеспечения Prism (GraphPad). Поскольку на одном планшете тестировали несколько лекарств, для сравнения эффектов клеток, обработанных лекарством, использовали один и тот же контроль ДМСО. Подписи к рисункам указывают, на каких панелях использовали один и тот же контроль ДМСО. Кинетику роста нормализовали идентично измерениям IncuCyte.

    Кривые роста AUC PHANTAST

    AUC рассчитывали, взяв сумму слияния во все моменты времени для каждого состояния.Это было установлено относительно роста клеточной линии путем деления каждого значения AUC на среднее значение AUC для контроля клеточной линии ДМСО для каждого планшета. Эти значения сравнивали между клеточными линиями на лекарство с помощью двустороннего теста t .

    Анализ наклона Кривые роста FIJI

    Кривые роста были построены в логарифмическом масштабе, и точка отсечки логарифмического роста оценивалась вручную для каждого условия. Чтобы рассчитать наклон, отрицательный логарифм слияния в этот момент времени был разделен на день отсечки: -log(отсечка слияния )/T отсечка .Это значение делили на средний наклон контрольной клеточной линии, чтобы компенсировать различия в росте клеточных линий. Повторы значений относительного наклона сравнивали между клеточными линиями в зависимости от состояния.

    Визуализация живых клеток и анализ CIN

    RPE1, Mad2 cKD Клетки RPE1, MCF7 и HT29, экспрессирующие h3B-GFP, обрабатывали, как указано, и визуализировали на микроскопе DeltaVision (Applied Precision Ltd.). Интерфазные фенотипы анализировали путем количественной оценки ядерной морфологии. Митотические аномалии количественно определяли вручную по изображениям живых клеток в течение ночи.Измерения включают по крайней мере три биологических повтора, а количество клеток указано в тексте. Критерий хи-квадрат использовался для проверки того, были ли различия между условиями значительными. Митотическое время анализировали путем расчета временных точек между первым признаком конденсации ДНК и последней точкой перед анафазой, а также от первой временной точки анафазы до временной точки полной деконденсации ДНК по данным замедленной визуализации.

    Анализ подвижности клеток

    Для количественной оценки подвижности клеток были проанализированы цейтраферные видеоролики с использованием FIJI TrackMate (Tinevez et al, 2017).Для каждого условия использовалось минимум 15 ночных изображений, включая не менее трех биологических повторов. Входные условия TrackMate были оптимизированы для каждого типа ячеек. Диаметр ядра RPE1 был установлен на уровне 20 мкМ, тогда как диаметр ядра MCF7 был установлен на уровне 15 мкМ. Статистика треков по условиям была объединена, и скорость трека была построена в R ggPlot2 (Wickham, 2016). Различия рассчитывали с помощью двусторонних тестов t .

    Анализ движения МТ

    Скорости сборки МТ плюс концы определяли путем отслеживания белка EB3-GFP (вектор любезно предоставлен Линдой Вордеман) в экспериментах по микроскопии живых клеток, как в Ertych et al (2014).Средние скорости сборки (микрометры в минуту) рассчитывали на основе данных, полученных для 20 отдельных МТ на клетку, которые были выбраны случайным образом. Всего было проанализировано 20 клеток из трех независимых экспериментов. Значимость оценивали с помощью двустороннего непарного теста t .

    Устранение ошибок репликации 8456 или 8457 — Windows Server

    • Статья
    • 8 минут на чтение
    • 3 участника

    Полезна ли эта страница?

    да Нет

    Любая дополнительная обратная связь?

    Отзыв будет отправлен в Microsoft: при нажатии кнопки отправки ваш отзыв будет использован для улучшения продуктов и услуг Microsoft.Политика конфиденциальности.

    Представлять на рассмотрение

    В этой статье

    В этой статье описываются признаки, причины и действия по устранению ситуаций, когда операции Active Directory завершаются сбоем с ошибкой 8456 или 8457.

    Применяется к:   Windows Server 2012 R2
    Исходный номер базы знаний:   2023007

    Примечание

    Домашние пользователи: Эта статья предназначена только для агентов технической поддержки и ИТ-специалистов.Если вам нужна помощь в решении проблемы, обратитесь в сообщество Microsoft.

    Симптомы

    Операции Active Directory завершаются ошибкой 8456 или 8457: Источник | конечный сервер в настоящее время отклоняет запросы на репликацию.

    1. Продвижение DCPROMO нового контроллера домена в существующем лесу завершается с ошибкой: Исходный сервер в настоящее время отклоняет запросы на репликацию.

      Текст заголовка диалогового окна: Мастер установки Active Directory Текст диалогового сообщения:

      Операция завершилась неудачно, потому что: Active Directory не удалось передать оставшиеся данные в разделе каталога <путь DN раздела каталога> на контроллер домена <конечный контроллер домена>.«Исходный сервер в настоящее время отклоняет запросы на репликацию».

    2. DCDIAG сообщает об ошибке: Исходный сервер в настоящее время отклоняет запросы репликации или Целевой сервер в настоящее время отклоняет запросы репликации .

      Тестовый сервер: Default-First-Site-Name
      Запуск теста: Репликации
      * Проверка репликации
      [Replications Check,] Недавняя попытка репликации не удалась:
      От IADOMINO к
      Именование Контекст: DC=
      Репликация сгенерировала ошибку (8456):
      Исходный сервер в настоящее время отклоняет запросы на репликацию.
      Ошибка произошла в <дата> <время>.
      Последнее успешное выполнение произошло <дата> <время>.
      957 сбоев произошло с момента последнего успеха.
      Репликация была явно отключена с помощью параметров сервера

      Тестовый сервер: Default-First-Site-Name
      Запуск теста: Репликации
      * Проверка репликации
      [Replications Check,] Недавняя попытка репликации не удалась:
      От IADOMINO к
      Именование Контекст: DC=
      Репликация сгенерировала ошибку (8457):
      Сервер назначения в настоящее время отклоняет запросы на репликацию.
      Ошибка произошла в <дата> <время>.
      Последнее успешное выполнение произошло <дата> <время>.
      957 сбоев произошло с момента последнего успеха.
      Репликация была явно отключена с помощью параметров сервера

    3. REPADMIN указывает, что входящая и исходящая репликация Active Directory может завершаться ошибкой: источник | конечный сервер в настоящее время отклоняет репликацию.

      DC=Contoso,DC=COM
      <имя сайта><имя контроллера домена> через RPC
      GUID объекта контроллера домена:
      Последняя попытка @ <дата> <время> не удалась, результат 8457 (0x2109) :
      Целевой сервер в настоящее время отклоняет запросы на репликацию.

      DC=Contoso,DC=COM
      <имя сайта><имя контроллера домена> через RPC
      GUID объекта контроллера домена:
      Последняя попытка @ <дата> <время> не удалась, результат 8456 (0x2108) :
      Исходный сервер в настоящее время отклоняет запросы репликации.

      Примечание

      Команды REPADMIN могут отображать как шестнадцатеричный, так и десятичный эквивалент текущей ошибки репликации, которая отклоняет.

    4. Источники событий и идентификаторы событий, указывающие на то, что произошел откат USN, включают, помимо прочего, следующее.

      Источник события Идентификатор события Строка события
      НТДС КСС 1308 Средство проверки согласованности знаний (KCC) обнаружило, что последовательные попытки репликации со следующим контроллером домена постоянно терпят неудачу.
      НТДС КСС 1925 Не удалось установить ссылку репликации для следующего доступного для записи раздела каталога.
      НТДС КСС 1926 Попытка установить ссылку репликации на раздел каталога только для чтения со следующими параметрами не удалась
      Репликация NTDS 1586 Контрольная точка репликации Windows NT 4.0 или более ранней версии с главным эмулятором PDC не удалась. Полная синхронизация базы данных диспетчера учетных записей безопасности (SAM) с контроллерами домена под управлением Windows NT 4.0 и более ранних версий может произойти, если роль хозяина эмулятора PDC будет передана локальному контроллеру домена до следующей успешной контрольной точки.Процесс контрольной точки будет повторен через четыре часа.
      Репликация NTDS 2023 Локальный контроллер домена не смог реплицировать изменения на следующий удаленный контроллер домена для следующего раздела каталога.
      Microsoft-Windows-ActiveDirectory_DomainService 2095 Во время запроса репликации доменных служб Active Directory локальный контроллер домена (DC) идентифицировал удаленный контроллер домена, который получил данные репликации от локального контроллера домена, используя уже подтвержденные номера отслеживания USN.
      Microsoft-Windows-ActiveDirectory_DomainService 2103 База данных доменных служб Active Directory была восстановлена ​​с использованием неподдерживаемой процедуры восстановления. Доменные службы Active Directory не смогут входить в систему пользователей, пока сохраняется это условие. Поэтому служба сетевого входа в систему приостановлена.

      Где встроенные коды состояния 8456 и 8457 соответствуют следующим.

      Десятичная ошибка Шестнадцатеричная ошибка Строка ошибки
      8456 2108 Исходный сервер в настоящее время отклоняет репликацию
      8457 2109 Сервер назначения в настоящее время отклоняет репликацию
    5. Общее событие NTDS 2013 может быть зарегистрировано в журнале событий служб каталогов.Это указывает на то, что откат USN произошел из-за неподдерживаемого отката или восстановления базы данных Active Directory.

      Тип события: Ошибка
      Источник события: NTDS General
      Категория события: Управление службами
      Идентификатор события: 2103
      Дата: <дата>
      Время: <время>
      Пользователь: <имя пользователя>
      Компьютер: <имя компьютера>
      Описание : база данных Active Directory была восстановлена ​​с использованием неподдерживаемой процедуры восстановления. Active Directory не сможет входить в систему пользователей, пока сохраняется это условие.В результате служба сетевого входа в систему была приостановлена. Действия пользователя Подробности см. в предыдущих журналах событий. Для получения дополнительной информации посетите Центр справки и поддержки по телефону https://support.microsoft.com .

    6. Общее событие NTDS 1393 может быть зарегистрировано в журнале событий служб каталогов. Это указывает на то, что на физическом или виртуальном диске, на котором размещена база данных Active Directory или файлы журналов, недостаточно свободного места:

      .

      Тип события: Ошибка
      Источник события: NTDS General
      Категория события: Управление службами
      Идентификатор события: 1393
      Дата: <дата>
      Время: <время>
      Пользователь: <имя пользователя>
      Компьютер: <имя компьютера> Описание:
      Попытки обновить базу данных службы каталогов завершаются с ошибкой 112.Поскольку Windows не сможет входить в систему, пока сохраняется это условие, служба NetLogon приостановлена. Убедитесь, что на дисках, где находятся база данных каталога и файлы журналов, достаточно свободного места.

    Причина

    Входящая или исходящая репликация была автоматически отключена операционной системой по нескольким основным причинам.

    Три события, которые отключают входящую или исходящую репликацию, включают:

    • Произошел откат USN (общее событие NTDS 2103).
    • Жесткий диск заполнен (общее событие NTDS 1393).
    • Присутствует поврежденный вектор UTD (событие 2881).

    Операционная система автоматически вносит четыре изменения в конфигурацию при выполнении одного из трех условий. Четыре изменения конфигурации следующие:

    1. Входящая репликация Active Directory отключена.
    2. Исходящая репликация Active Directory отключена.
    3. DSA недоступен для записи имеет ненулевое значение в реестре.
    4. Состояние службы NETLOGON изменено с работает на приостановлено .

    Основной основной причиной этой ошибки является откат USN, описанный в разделе Контроллер домена Windows Server регистрирует событие службы каталогов 2095 при обнаружении отката USN.

    Не думайте, что любое ненулевое значение для DSA, недоступное для записи , или что исходный или конечный сервер в настоящее время отклоняет запросы на репликацию во время репликации DCPROMO/AD, окончательно означает, что произошел откат USN и что такие контроллеры домена неявно должны быть принудительно понижен в должности или принудительно повышен в должности.Понижение может быть правильным вариантом. Однако оно может быть чрезмерным, если ошибка вызвана недостаточным свободным местом на диске.

    Разрешение

    1. Проверьте значение для DSA недоступен для записи .

      Для каждого контроллера домена, регистрирующего ошибку 8456 или 8457, определите, отключило ли одно из трех инициирующих событий входящую или исходящую репликацию Active Directory автоматически, прочитав значение «DSA недоступно для записи» из локального реестра.

      Когда репликация автоматически отключена, операционная система записывает одно из четырех возможных значений в DSA недоступен для записи :

      • Путь: HKEY_LOCAL_MACHINE\System\CurrentControlSet\Services\NTDS\Parameters
      • Параметр: DSA недоступен для записи
      • Тип: Reg_dword
      • Значения:
        • # определить DSA_WRITABLE_GEN 1
        • # определить DSA_WRITABLE_NO_SPACE 2
        • # определить DSA_WRITABLE_USNROLLBCK 4
        • # определить DSA_WRITABLE_CORRUPT_UTDV 8

      Значение 1 может быть записано только в том случае, если версия леса несовместима с ОС (например, контроллер домена W2K повышается до леса функционального уровня леса Windows Server 2003 и т.п.).

      Значение 2 означает, что на физическом или виртуальном диске, на котором размещена база данных Active Directory или файлы журналов, недостаточно свободного места.

      Значение 4 означает, что откат USN произошел из-за неправильного отката базы данных Active Directory во времени. Операции, которые, как известно, вызывают откат USN, включают следующее:

      • Загрузка с ранее сохраненных снимков виртуальных машин компьютеров с ролью контроллера домена на узлах Hyper-V или VMWARE.
      • Неверное преобразование физического в виртуальный (P2V) в лесах, содержащих более одного контроллера домена.
      • Восстановление компьютеров с ролью DC с помощью продуктов для работы с образами, таких как Ghost.
      • Откат содержимого раздела, на котором размещена база данных Active Directory, в прошлое с помощью расширенной дисковой подсистемы.

      Значение 8 указывает на то, что вектор обновления на локальном контроллере домена поврежден.

      Технически DSA недоступен для записи может состоять из нескольких значений.Например, значение реестра 10 указывает на нехватку места на диске и поврежденный UTD. Как правило, одно значение записывается в DSA, недоступное для записи .

      Примечание

      Специалисты службы поддержки и администраторы часто частично отключают карантин репликации, включая исходящую репликацию, включая входящую репликацию, изменяя значение запуска службы NETLOGON с отключенного на автоматический и запуская службу NETLOGON. Таким образом, полная конфигурация карантина может отсутствовать на момент проверки.

    2. Проверьте журнал событий службы каталогов на наличие событий карантина.

      Предполагая, что журнал событий службы каталогов не упакован, вы можете обнаружить одно или несколько связанных событий, зарегистрированных в журнале событий службы каталогов контроллера домена, который регистрирует ошибку 8456 или 8457.

      Событие Детали
      NTDS Общие 2103 База данных Active Directory была восстановлена ​​с использованием неподдерживаемой процедуры восстановления.Active Directory не сможет входить в систему пользователей, пока сохраняется это условие. Поэтому служба сетевого входа в систему приостановлена. Действия пользователя Дополнительную информацию см. в предыдущих журналах событий.
      Общее событие NTDS 1393 На диске недостаточно места.
      Событие 2881 Неприменимо
    3. Выполните восстановление на основе значения DSA, недоступного для записи , или событий, зарегистрированных в системе:

      • Если DSA недоступен для записи равно 4 или если зарегистрировано общее событие NTDS 2103, выполните шаги восстановления для отката USN.Дополнительные сведения см. в статье Контроллер домена Windows Server регистрирует событие службы каталогов 2095 при обнаружении отката USN.

      • Если DSA недоступен для записи равно 2 или если зарегистрировано общее событие NTDS 1393, проверьте наличие достаточного свободного места на физическом и виртуальном разделах, на которых размещаются база данных Active Directory и файлы журналов. Освободите место по мере необходимости.

      • Если DSA недоступен для записи равно 8, понизьте, а затем повторно повысьте уровень контроллера домена, прежде чем он сможет реплицировать свое неверное значение на другие контроллеры домена в лесу.

    Энтони Уиншоу-Борис | Program for Autism Education and Research

    Исследования в лаборатории доктора Уиншоу-Борис сосредоточены на понимании генетических и биохимических путей, важных для развития и функционирования центральной нервной системы млекопитающих, в основном с использованием моделей мышей и совсем недавно индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК). ) заболеваний человека и млекопитающих для определения путей, нарушенных при этих заболеваниях.

    В настоящее время в лаборатории есть четыре основных проекта: роль трех генов Disheveled мыши на раннем этапе развития; генетика и патофизиология аутизма и социального поведения, с особым акцентом на пути, ответственные за разрастание мозга; человеческие модели iPSC микроцефалии и ранней нейродегенерации, вызванной мутациями в генах репарации ДНК и контрольных точек; и, наконец, разработка новой концепции под названием «Хромосомная терапия», основанной на коррекции больших хромосомных аберраций путем индукции кольцевых хромосом в ИПСК, полученных от пациентов.

    Растрепанные мышиные мутанты: исследование многофункционального избыточного семейства генов

    Лаборатория доктора Уиншоу-Борис создала мышей с мутациями в каждом из трех генов Disheveled (Dvl) и обнаружила частично уникальные, но преимущественно избыточные функции среди трех генов Dvl. В подтверждение уникальных функций каждого из Dvls, отдельные мутанты по Dvl1 обнаруживают новые аномалии социального поведения, в то время как мутанты Dvl2 и Dvl3 умирают при рождении с конотрункальными дефектами сердца и обнаруживают кохлеарные аномалии.Двойные мутанты Dvl1;Dvl3 демонстрируют более серьезные поведенческие дефекты (неопубликованные данные), в то время как двойные мутанты Dvl1;Dvl2 и Dvl2;Dvl3 обнаруживают серьезные дефекты нервной трубки (краниорахишизис) и серьезные дефекты улитки. Наконец, тройные мутанты Dvl1;Dvl2;Dvl3 умирают вскоре после имплантации, поддерживая избыточные функции среди генов Dvl. Теперь они используют эти инструменты для всестороннего анализа роли канонических путей Wnt и неканонических путей Wnt/PCP на ранних стадиях развития. Кроме того, они изучают роль Dvls в сложном поведении млекопитающих, таком как социальное поведение, реакции страха и сенсомоторная активность.

    Аутизм и ранний избыточный рост мозга

    Недавний интерес к лаборатории Уиншоу-Бориса связан с аутизмом. За последние несколько лет стало очевидным, что аутизм, в высшей степени наследуемое заболевание, по-видимому, связан с разрастанием мозга, хотя точное время и причина этого разрастания неизвестны. Они изучают вариации генов и путей, важных для нейрогенеза, митоза и апоптоза при аутизме. Эти пути напрямую связаны с их исследованиями путей Disheveled и путей важной миграции нейронов.Следует отметить, что в посмертных исследованиях молодых аутичных людей они обнаружили новую корковую аномалию, которая может быть фундаментальной для развития аутизма. В недавней публикации были обнаружены уникальные аномалии в экспрессии генов дорсолатеральной префронтальной коры молодых пациентов с аутизмом по сравнению с типично развивающимися детьми. В настоящее время они получили iPS-клетки от пациентов с аутизмом, у которых наблюдался ранний чрезмерный рост мозга и контроля, неаутичных людей с нормальным размером мозга, чтобы увидеть, существуют ли клеточные фенотипы, связанные с ранним чрезмерным ростом мозга.

    Модели иПСК человека Микроцефалия и нейродегенерация в результате мутаций в генах репарации ДНК и контрольных точках

    Микроцефалия обычно встречается изолированно или в более сложных синдромальных формах заболеваний нервной системы и может быть связана с неврологическими дефектами, структурными аномалиями головного мозга, тяжелой умственной отсталостью и судорогами. Мутации в генах репарации ДНК могут привести к микроцефалии, демонстрируя, что поддержание стабильности генома имеет решающее значение для правильного развития нервной системы и размера головы.Вполне вероятно, что микроцефалия, вызванная мутациями в генах репарации ДНК, связана с аномальной пролиферацией и/или усилением апоптоза во время нейрогенеза, но механизмы, ответственные за микроцефалию, плохо изучены. Мы создали модели индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) у пациентов с микроцефалией, вызванной мутациями в генах путей репарации ДНК LIG4, PNKP и NBN. В качестве контроля мы создали изогенные линии пациентов, которые исправили мутации в этих генах с помощью редактирования генома CRISPR/Cas9, иПСК от пациентов с мутациями в гене ATM, который важен для ответа на повреждение ДНК, но не проявляет микроцефалию, и иПСК от не затронутые лица.Мы использовали эти полученные от пациентов и контрольные ИПСК для создания клеток-предшественников нейронов (NPC) и корковых нейронов, а также трехмерных церебральных органоидов. Эти инструменты позволят нам изучать пролиферацию, апоптоз и дифференцировку однородных популяций клеток, а также ранние самоорганизующиеся нейронные структуры в органоидах.

    Хромосомная терапия: коррекция больших хромосомных аберраций путем индукции кольцевых хромосом в ИПСК, полученных от пациентов

    Приблизительно 1 из 500 новорожденных рождается с хромосомными аномалиями, которые включают трисомии, транслокации, большие делеции и дупликации.В настоящее время не существует терапевтического подхода для коррекции таких хромосомных аберраций in vivo или in vitro. Недавно мы попытались получить модели индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) пациентов, содержащих кольцевые хромосомы: одного с кольцевой хромосомой 17 (r17) и двух пациентов с разными кольцевыми хромосомами 13 (r13). Удивительно, но хотя все три линии были эффективно перепрограммированы в ИПСК, кольцевые хромосомы были удалены и заменены дублированной нормальной копией хромосомы 17 в линии r17 и нормальными копиями хромосомы 13 в линиях r13 (Bershteyn et al.2014, Природа 506:99). Это открытие предложило потенциальную терапевтическую стратегию для коррекции крупномасштабных хромосомных аберраций. Мы предположили, что хромосома с большой аберрацией может быть скорректирована путем образования кольцевой хромосомы из аберрантной хромосомы в ИПСК, которая затем будет удалена и заменена нормальной хромосомой. Мы проверяем эту гипотезу, пытаясь индуцировать образование кольца у пациентов с большими делециями хромосомы 17 с помощью подхода Cre/loxP. В случае успеха мы получим обобщаемую систему «хромосомной терапии» для коррекции больших хромосомных аберраций путем индукции кольцевых хромосом посредством редактирования генома с последующей потерей кольца и дублированием нормальной хромосомы.

    (PDF) Клеточный цикл и реакция на повреждение ДНК в постмитотических нейронах

    Клеточный цикл и реакция на повреждение ДНК в постмитотических нейронах

    279

    Васева А.В.; Марченко Н.Д., Молл Ю.М. (2009). Независимая от транскрипции программа

    митохондриального p53 вносит основной вклад в индуцированный нутлином апоптоз в

    опухолевых клетках. Cell Cycle, Vol.8, No.11, (июнь 2009 г.), стр. 1711–1719, ISSN 1941–1846

    Vaze, MB; Пелличиоли, А .; Ли, С.Э.; Ира, Г.; Либери, Г.; Арбель-Эден, А .; Фояни, М. и Хабер Дж. Э.

    (2002) Для восстановления после остановки, опосредованной контрольной точкой, после восстановления двухцепочечного разрыва

    требуется геликаза Srs2. Мол Ячейка, Том. 10, № 2 (август 2002 г.), стр. 373–385,

    ISSN 1219-1482

    Вазири, Х.; Дессен, СК; Нг Итон, Э.; Имаи С., Фрай Р.А.; Пандита, Т.К.; Guarente, L. &

    Weinberg, R.A. (2001). hSIR2(SIRT1) функционирует как НАД-зависимая р53

    деацетилаза.Cell, Vol.107, No.2, (октябрь 2001 г.), стр. 149-159, ISSN 1167-2523

    Waldman, T.; Ленгауэр, К.; Кинзлер, К.В. и Фогельштейн, Б. (1996). Разобщение S фазы

    и митоз, индуцированный противоопухолевыми агентами в клетках, лишенных p21. Nature, Vol.381,

    No.6584, (июнь 1996 г.), стр. 713-716, ISSN 864-9519

    Waldman, T.; Чжан, Ю .; Диллехай, Л.; Ю, Дж.; Кинзлер, К.; Фогельштейн, Б. и Уильямс, Дж. (1997).

    Клеточный цикл, остановка или гибель клеток при лечении рака.Nat Med, Vol.3, No.9,

    (сентябрь 1997 г.), стр. 1034-1036, ISSN 928-8734

    Wang, M.; Ву, В .; Ву, В .; Розиди, Б.; Чжан, Л.; Ван, Х. и Илиакис, Г. (2006). PARP-1 и Ku

    конкурируют за репарацию двухцепочечных разрывов ДНК разными путями NHEJ. Nucleic

    Acids Res, 2006; Vol.34, No.21, (ноябрь 2006 г.), стр. 6170-6182, ISSN 1708-8286

    Ward, IM & Chen, J. (2001). Гистон h3AX фосфорилируется ATR-зависимым образом в ответ на репликационный стресс.J Biol Chem, Vol.276, No.51, (октябрь

    2001), стр. 47759-47762, ISSN 1167-3449

    Warbrick, E.; Лейн, Д.П.; Гловер, Д.М. и Кокс, Л.С. (1995). Малый пептидный ингибитор репликации ДНК

    определяет сайт взаимодействия между ингибитором циклинзависимой киназы

    p21WAF1 и ядерным антигеном пролиферирующих клеток. Curr Biol, Vol.5, No.3,

    (март 1995 г.), стр. 275-282, ISSN 778-0738

    Wefel, J.S.; Кайл, А.Э. и Мейерс, К.А.(2004). Нейропсихологическая дисфункция, связанная

    с раком и терапией рака: концептуальный обзор новой цели. Br J

    Рак, Том. 90, № 9 (май 2004 г.), стр. 1691-1696, ISSN 1515-0608

    Weissman, L.; де Соуза-Пинто, Северная Каролина; Стивенснер, Т. и Бор, В.А. (2007). Репарация ДНК,

    митохондрий и нейродегенерация. Неврология, Том. 145, № 4 (ноябрь,

    2006 г.), стр. 1318–1329, ISSN 1709-2652

    Wilker, EW; Ван Вугт, М.А.; Артим, С.А.; Хуанг, П. Х.; Петерсен, CP; Рейнхардт, ХК;

    Фэн Ю.; Шарп, Пенсильвания; Зоненберг, Н.; Уайт, Ф.М. и Яффе, М.Б. (2007). 14-3-3sigma

    контролирует митотическую трансляцию для облегчения цитокинеза. Nature, Vol.446, No.7133 (март

    2007), стр. 329-332, ISSN 1736-1185

    Wilson, DM 3rd. и Макнил, Д. Р. (2007). Базис эксцизионной репарации и центральной нервной

    системы. Neuroscience, Vol.145, No.4 (август 2006 г.), стр. 1187–1200, ISSN 1693-4943

    Xiong, Y.; Хэннон, Г.Дж.; Чжан, Х .; Кассо, Д.; Кобаяши, Р. и Бич, Д. (1993). р21 является

    универсальным ингибитором циклинкиназ. Nature, Vol.366, No.6456, (декабрь 1993 г.),

    pp.701-704, ISSN 825-9214

    Xu Y, Sun Y, Jiang X, Ayrapetov MK, Moskwa P, Yang S, Weinstock DM, Цена БД. (2010).

    АТФаза p400 регулирует стабильность нуклеосом и убиквитинирование хроматина

    во время репарации ДНК. J Cell Biol, Vol.191, No.1, (сентябрь 2010 г.), стр. 31-43, ISSN

    2087-6283

    Yamaguchi, H.; Вудс, Северная Каролина; Пилузо, Л.Г.; Ли, Х.Х.; Чен, Дж.; Бхалла, К.Н.; Монтейро, А .;

    Лю, Х.; Хунг, М.К. и Ван, HG (2009). Ацетилирование p53 имеет решающее значение для его

    Использование реакции на повреждение ДНК (DDR) для изменения парадигмы лечения

    Размышляя о презентациях, представленных в рамках Виртуальной научной программы ASCO 2020, интересно подумать о том, как эволюционировало наше понимание таргетной терапии и парадигмы лечения. Рак — очень сложное и гетерогенное заболевание, и хотя разнообразие биологии опухоли может быть одним из самых сложных аспектов в лечении рака, это также слабость, которую мы можем использовать. 1  Мы добились значительных успехов в нашей способности более эффективно лечить заболевание за счет лучшего понимания биологии рака и генетических факторов, которые стимулируют развитие опухоли, а также специфической биологии людей, на которых она влияет.

    Некоторые виды рака особенно трудно поддаются лечению, будь то из-за того, что они развили резистентность к лечению, например, устойчивый к кастрации рак предстательной железы, который больше не отвечает на гормональную терапию, или из-за локализации рака в организме, например, рака поджелудочной железы. рак, который находится в месте пересечения крупных кровеносных сосудов, что затрудняет хирургическое вмешательство. 2,3  Для этих видов рака необходим более персонализированный, целенаправленный подход.

    Здесь мы углубляемся в генетический профиль опухоли, оценивая, какие из особенностей, влияющих на этиологию рака, могут быть использованы в наших интересах. Известно, что раковые клетки имеют невероятно высокий уровень мутаций, что приводит к дисфункции клеточного механизма и повреждению ДНК, и, хотя раковые клетки могут выжить при определенном уровне повреждения, этому есть предел. 4 Есть ахиллесова пята.

    Наша цель — разработать инновационные, целенаправленные и основанные на биомаркерах методы лечения, которые могут использовать эту слабость, и подобрать методы лечения для пациентов, которые, скорее всего, получат от них пользу.

    Одним из основных направлений нашей деятельности является реакция на повреждение ДНК (DDR). DDR состоит из сотен белков, которые контролируют, распознают и восстанавливают поврежденную ДНК. 5,6  Многие виды рака имеют дефекты в различных путях репарации ДНК, что делает клетки более восприимчивыми к повреждению ДНК и более зависимыми от оставшихся путей репарации. 4 Запрещая альтернативные пути восстановления или контрольные точки клеточного цикла, которые дают время для восстановления, мы можем максимизировать повреждение ДНК, чтобы избирательно вызвать гибель раковых клеток, но как мы узнаем, какие типы рака должны быть нацелены?

     

    Конгресс.гов | Библиотека Конгресса

    Раздел протокола Конгресса Ежедневный дайджест Сенат жилой дом Расширения замечаний

    Замечания участников Автор Any House MemberАдамс, Альма С.[D-NC] Адерхольт, Роберт Б. [R-AL] Агилар, Пит [D-CA] Аллен, Рик В. [R-GA] Оллред, Колин З. [D-TX] Амодеи, Марк Э. [R -NV] Армстронг, Келли [R-ND] Аррингтон, Джоди С. [R-TX] Окинклосс, Джейк [D-MA] Эксн, Синтия [D-IA] Бабин, Брайан [R-TX] Бэкон, Дон [R -NE] Бэрд, Джеймс Р. [R-IN] Балдерсон, Трой [R-OH] Бэнкс, Джим [R-IN] Барр, Энди [R-KY] Барраган, Нанетт Диаз [D-CA] Басс, Карен [ D-CA] Битти, Джойс [D-OH] Бенц, Клифф [R-OR] Бера, Ами [D-CA] Бергман, Джек [R-MI] Бейер, Дональд С.-младший [D-VA] Байс , Стефани И. [R-OK] Биггс, Энди [R-AZ] Билиракис, Гас М.[R-FL] Бишоп, Дэн [R-NC] Бишоп, Сэнфорд Д., младший [D-GA] Блюменауэр, Эрл [D-OR] Блант Рочестер, Лиза [D-DE] Боберт, Лорен [R-CO ] Бонамичи, Сюзанна [D-OR] Бост, Майк [R-IL] Бурдо, Кэролайн [D-GA] Боуман, Джамаал [D-NY] Бойл, Брендан Ф. [D-PA] Брэди, Кевин [R-TX ] Брукс, Мо [R-AL] Браун, Энтони Г. [D-MD] Браун, Шонтел М. [D-OH] Браунли, Джулия [D-CA] Бьюкенен, Верн [R-FL] Бак, Кен [R -CO] Бакшон, Ларри [R-IN] Бадд, Тед [R-NC] Берчетт, Тим [R-TN] Берджесс, Майкл С. [R-TX] Буш, Кори [D-MO] Бустос, Чери [D -ИЛ] Баттерфилд, Г.К. [D-NC] Калверт, Кен [R-CA] Каммак, Кэт [R-FL] Карбахал, Салуд О. [D-CA] Карденас, Тони [D-CA] Кэри, Майк [R-OH] Карл , Джерри Л. [R-AL] Карсон, Андре [D-IN] Картер, Эрл Л. «Бадди» [R-GA] Картер, Джон Р. [R-TX] Картер, Трой [D-LA] Картрайт, Мэтт [D-PA] Кейс, Эд [D-HI] Кастен, Шон [D-IL] Кастор, Кэти [D-FL] Кастро, Хоакин [D-TX] Коуторн, Мэдисон [R-NC] Шабо, Стив [ R-OH] Чейни, Лиз [R-WY] Черфилус-МакКормик, Шейла [D-FL] Чу, Джуди [D-CA] Чичиллин, Дэвид Н. [D-RI] Кларк, Кэтрин М. [D-MA] Кларк, Иветт Д.[D-NY] Кливер, Эмануэль [D-MO] Клайн, Бен [R-VA] Клауд, Майкл [R-TX] Клайберн, Джеймс Э. [D-SC] Клайд, Эндрю С. [R-GA] Коэн , Стив [D-TN] Коул, Том [R-OK] Комер, Джеймс [R-KY] Коннолли, Джеральд Э. [D-VA] Купер, Джим [D-TN] Корреа, Дж. Луис [D-CA ] Коста, Джим [D-CA] Кортни, Джо [D-CT] Крейг, Энджи [D-MN] Кроуфорд, Эрик А. «Рик» [R-AR] Креншоу, Дэн [R-TX] Крист, Чарли [ D-FL] Кроу, Джейсон [D-CO] Куэльяр, Генри [D-TX] Кертис, Джон Р. [R-UT] Дэвидс, Шарис [D-KS] Дэвидсон, Уоррен [R-OH] Дэвис, Дэнни К. [D-IL] Дэвис, Родни [R-IL] Дин, Мадлен [D-PA] ДеФацио, Питер А.[D-OR] ДеГетт, Диана [D-CO] ДеЛауро, Роза Л. [D-CT] ДельБене, Сьюзан К. [D-WA] Дельгадо, Антонио [D-NY] Демингс, Вэл Батлер [D-FL] ДеСолнье, Марк [D-CA] ДеЖарле, Скотт [R-TN] Дойч, Теодор Э. [D-FL] Диас-Баларт, Марио [R-FL] Дингелл, Дебби [D-MI] Доггетт, Ллойд [D- TX] Дональдс, Байрон [R-FL] Дойл, Майкл Ф. [D-PA] Дункан, Джефф [R-SC] Данн, Нил П. [R-FL] Эллзи, Джейк [R-TX] Эммер, Том [ R-MN] Эскобар, Вероника [D-TX] Эшу, Анна Г. [D-CA] Эспайлат, Адриано [D-NY] Эстес, Рон [R-KS] Эванс, Дуайт [D-PA] Фэллон, Пэт [ R-TX] Финстра, Рэнди [R-IA] Фергюсон, А.Дрю, IV [R-GA] Фишбах, Мишель [R-MN] Фицджеральд, Скотт [R-WI] Фицпатрик, Брайан К. [R-PA] Флейшманн, Чарльз Дж. «Чак» [R-TN] Флетчер, Лиззи [D-TX] Фортенберри, Джефф [R-NE] Фостер, Билл [D-IL] Фокс, Вирджиния [R-NC] Франкель, Лоис [D-FL] Франклин, К. Скотт [R-FL] Фадж, Марсия Л. [D-OH] Фулчер, Расс [R-ID] Гаетц, Мэтт [R-FL] Галлахер, Майк [R-WI] Галлего, Рубен [D-AZ] Гараменди, Джон [D-CA] Гарбарино, Эндрю Р. [R-NY] Гарсия, Хесус Г. «Чуй» [D-IL] Гарсия, Майк [R-CA] Гарсия, Сильвия Р. [D-TX] Гиббс, Боб [R-OH] Хименес, Карлос А. .[R-FL] Гомерт, Луи [R-TX] Голден, Джаред Ф. [D-ME] Гомес, Джимми [D-CA] Гонсалес, Тони [R-TX] Гонсалес, Энтони [R-OH] Гонсалес, Висенте [D-TX] Гонсалес-Колон, Дженниффер [R-PR] Гуд, Боб [R-VA] Гуден, Лэнс [R-TX] Госар, Пол А. [R-AZ] Готхаймер, Джош [D-NJ] Грейнджер , Кей [R-TX] Грейвс, Гаррет [R-LA] Грейвс, Сэм [R-MO] Грин, Эл [D-TX] Грин, Марк Э. [R-TN] Грин, Марджори Тейлор [R-GA] Гриффит, Х. Морган [R-VA] Грихальва, Рауль М. [D-AZ] Гротман, Гленн [R-WI] Гест, Майкл [R-MS] Гатри, Бретт [R-KY] Хааланд, Дебра А.[D-NM] Хагедорн, Джим [R-MN] Хардер, Джош [D-CA] Харрис, Энди [R-MD] Харшбаргер, Диана [R-TN] Харцлер, Вики [R-MO] Гастингс, Элси Л. [D-FL] Хейс, Джахана [D-CT] Херн, Кевин [R-OK] Херрелл, Иветт [R-NM] Эррера Бейтлер, Хайме [R-WA] Хайс, Джоди Б. [R-GA] Хиггинс, Брайан [D-NY] Хиггинс, Клэй [R-LA] Хилл, Дж. Френч [R-AR] Хаймс, Джеймс А. [D-CT] Хинсон, Эшли [R-IA] Холлингсворт, Трей [R-IN] Хорсфорд, Стивен [D-NV] Хулахан, Крисси [D-PA] Хойер, Стени Х. [D-MD] Хадсон, Ричард [R-NC] Хаффман, Джаред [D-CA] Хьюзенга, Билл [R-MI] Исса, Даррелл Э.[R-CA] Джексон Ли, Шейла [D-TX] Джексон, Ронни [R-TX] Джейкобс, Крис [R-NY] Джейкобс, Сара [D-CA] Джаяпал, Прамила [D-WA] Джеффрис, Хаким С. [D-NY] Джонсон, Билл [R-OH] Джонсон, Дасти [R-SD] Джонсон, Эдди Бернис [D-TX] Джонсон, Генри С. «Хэнк» младший [D-GA] Джонсон, Майк [R-LA] Джонс, Мондер [D-NY] Джордан, Джим [R-OH] Джойс, Дэвид П. [R-OH] Джойс, Джон [R-PA] Кахеле, Кайалии [D-HI] Каптур , Марси [D-OH] Катко, Джон [R-NY] Китинг, Уильям Р. [D-MA] Келлер, Фред [R-PA] Келли, Майк [R-PA] Келли, Робин Л. [D-IL ] Келли, Трент [R-MS] Ханна, Ро [D-CA] Килди, Дэниел Т.[D-MI]Килмер, Дерек [D-WA]Ким, Энди [D-NJ]Ким, Янг [R-CA]Кинд, Рон [D-WI]Кинзингер, Адам [R-IL]Киркпатрик, Энн [D -AZ] Кришнамурти, Раджа [D-IL] Кастер, Энн М. [D-NH] Кустофф, Дэвид [R-TN] ЛаХуд, Дарин [R-IL] ЛаМальфа, Дуг [R-CA] Лэмб, Конор [D -PA] Ламборн, Дуг [R-CO] Ланжевен, Джеймс Р. [D-RI] Ларсен, Рик [D-WA] Ларсон, Джон Б. [D-CT] Латта, Роберт Э. [R-OH] ЛаТернер , Джейк [R-KS] Лоуренс, Бренда Л. [D-MI] Лоусон, Эл, младший [D-FL] Ли, Барбара [D-CA] Ли, Сьюзи [D-NV] Леже Фернандес, Тереза ​​[D -NM] Леско, Дебби [R-AZ] Летлоу, Джулия [R-LA] Левин, Энди [D-MI] Левин, Майк [D-CA] Лью, Тед [D-CA] Лофгрен, Зои [D-CA] ] Лонг, Билли [R-MO] Лоудермилк, Барри [R-GA] Ловенталь, Алан С.[D-CA] Лукас, Фрэнк Д. [R-OK] Люткемейер, Блейн [R-MO] Лурия, Элейн Г. [D-VA] Линч, Стивен Ф. [D-MA] Мейс, Нэнси [R-SC ] Малиновски, Том [D-NJ] Маллиотакис, Николь [R-NY] Мэлони, Кэролин Б. [D-NY] Мэлони, Шон Патрик [D-NY] Манн, Трейси [R-KS] Мэннинг, Кэти Э. [ D-NC] Мэсси, Томас [R-KY] Маст, Брайан Дж. [R-FL] Мацуи, Дорис О. [D-CA] МакБат, Люси [D-GA] Маккарти, Кевин [R-CA] Маккол, Майкл Т. [R-TX] Макклейн, Лиза К. [R-MI] МакКлинток, Том [R-CA] МакКоллум, Бетти [D-MN] МакИчин, А. Дональд [D-VA] Макговерн, Джеймс П.[D-MA] МакГенри, Патрик Т. [R-NC] МакКинли, Дэвид Б. [R-WV] МакМоррис Роджерс, Кэти [R-WA] МакНерни, Джерри [D-CA] Микс, Грегори В. [D- Нью-Йорк] Мейер, Питер [R-MI] Менг, Грейс [D-NY] Мейзер, Дэниел [R-PA] Мфуме, Квейси [D-MD] Миллер, Кэрол Д. [R-WV] Миллер, Мэри Э. [ R-IL] Миллер-Микс, Марианнетт [R-IA] Муленаар, Джон Р. [R-MI] Муни, Александр X. [R-WV] Мур, Барри [R-AL] Мур, Блейк Д. [R- UT] Мур, Гвен [D-WI] Морелл, Джозеф Д. [D-NY] Моултон, Сет [D-MA] Мрван, Фрэнк Дж. [D-IN] Маллин, Маркуэйн [R-OK] Мерфи, Грегори [ R-NC] Мерфи, Стефани Н.[D-FL] Надлер, Джеррольд [D-NY] Наполитано, Грейс Ф. [D-CA] Нил, Ричард Э. [D-MA] Негус, Джо [D-CO] Нельс, Трой Э. [R-TX ] Ньюхаус, Дэн [R-WA] Ньюман, Мари [D-IL] Норкросс, Дональд [D-NJ] Норман, Ральф [R-SC] Нортон, Элеонора Холмс [D-DC] Нуньес, Девин [R-CA] О’Халлеран, Том [D-AZ] Обернольте, Джей [R-CA] Окасио-Кортес, Александрия [D-NY] Омар, Ильхан [D-MN] Оуэнс, Берджесс [R-UT] Палаццо, Стивен М. [ R-MS] Паллоне, Фрэнк-младший [D-NJ] Палмер, Гэри Дж. [R-AL] Панетта, Джимми [D-CA] Паппас, Крис [D-NH] Паскрелл, Билл-младший [D- Нью-Джерси] Пейн, Дональд М., младший [D-NJ] Пелоси, Нэнси [D-CA] Пенс, Грег [R-IN] Перлмуттер, Эд [D-CO] Перри, Скотт [R-PA] Питерс, Скотт Х. [D-CA] Пфлюгер, Август [R-TX] Филлипс, Дин [D-MN] Пингри, Челли [D-ME] Пласкетт, Стейси Э. [D-VI] Покан, Марк [D-WI] Портер, Кэти [D-CA] Поузи, Билл [R-FL] Прессли, Аянна [D-MA] Прайс, Дэвид Э. [D-NC] Куигли, Майк [D-IL] Радеваген, Аумуа Амата Коулман [R-AS] Раскин, Джейми [D- MD] Рид, Том [R-NY] Решенталер, Гай [R-PA] Райс, Кэтлин М. [D-NY] Райс, Том [R-SC] Ричмонд, Седрик Л. [D-LA] Роджерс, Гарольд [ R-KY] Роджерс, Майк Д.[R-AL] Роуз, Джон В. [R-TN] Розендейл-старший, Мэтью М. [R-MT] Росс, Дебора К. [D-NC] Роузер, Дэвид [R-NC] Рой, Чип [R -TX] Ройбал-Аллард, Люсиль [D-CA]Руис, Рауль [D-CA]Рупперсбергер, CA Датч [D-MD]Раш, Бобби Л. [D-IL]Резерфорд, Джон Х. [R-FL] Райан, Тим [D-OH] Саблан, Грегорио Килили Камачо [D-MP] Салазар, Мария Эльвира [R-FL] Сан-Николас, Майкл FQ [D-GU] Санчес, Линда Т. [D-CA] Сарбейнс, Джон П. [D-MD] Скализ, Стив [R-LA] Скэнлон, Мэри Гей [D-PA] Шаковски, Дженис Д. [D-IL] Шифф, Адам Б. [D-CA] Шнайдер, Брэдли Скотт [D -IL] Шредер, Курт [D-OR] Шриер, Ким [D-WA] Швайкерт, Дэвид [R-AZ] Скотт, Остин [R-GA] Скотт, Дэвид [D-GA] Скотт, Роберт С.«Бобби» [D-VA] Сешнс, Пит [R-TX] Сьюэлл, Терри А. [D-AL] Шерман, Брэд [D-CA] Шеррилл, Мики [D-NJ] Симпсон, Майкл К. [R- ID] Сиры, Альбио [D-NJ] Слоткин, Элисса [D-MI] Смит, Адам [D-WA] Смит, Адриан [R-NE] Смит, Кристофер Х. [R-NJ] Смит, Джейсон [R- MO] Смакер, Ллойд [R-PA] Сото, Даррен [D-FL] Спанбергер, Эбигейл Дэвис [D-VA] Спартц, Виктория [R-IN] Спейер, Джеки [D-CA] Стэнсбери, Мелани Энн [D- NM] Стэнтон, Грег [D-AZ] Штаубер, Пит [R-MN] Стил, Мишель [R-CA] Стефаник, Элиз М. [R-NY] Стайл, Брайан [R-WI] Штойбе, В.Грегори [R-FL] Стивенс, Хейли М. [D-MI] Стюарт, Крис [R-UT] Стиверс, Стив [R-OH] Стрикленд, Мэрилин [D-WA] Суоцци, Томас Р. [D-NY] Суолвелл, Эрик [D-CA] Такано, Марк [D-CA] Тейлор, Ван [R-TX] Тенни, Клаудия [R-NY] Томпсон, Бенни Г. [D-MS] Томпсон, Гленн [R-PA] Томпсон, Майк [D-CA] Тиффани, Томас П. [R-WI] Тиммонс, Уильям Р. IV [R-SC] Титус, Дина [D-NV] Тлайб, Рашида [D-MI] Тонко, Пол [D -NY] Торрес, Норма Дж. [D-CA] Торрес, Ричи [D-NY] Трэхан, Лори [D-MA] Троун, Дэвид Дж. [D-MD] Тернер, Майкл Р. [R-OH] Андервуд , Лорен [D-IL] Аптон, Фред [R-MI] Валадао, Дэвид Г.[R-CA] Ван Дрю, Джефферсон [R-NJ] Ван Дайн, Бет [R-TX] Варгас, Хуан [D-CA] Визи, Марк А. [D-TX] Вела, Филемон [D-TX] Веласкес , Нидия М. [D-NY] Вагнер, Энн [R-MO] Уолберг, Тим [R-MI] Валорски, Джеки [R-IN] Вальц, Майкл [R-FL] Вассерман Шульц, Дебби [D-FL] Уотерс, Максин [D-CA] Уотсон Коулман, Бонни [D-NJ] Вебер, Рэнди К. старший [R-TX] Вебстер, Дэниел [R-FL] Уэлч, Питер [D-VT] Венструп, Брэд Р. [R-OH] Вестерман, Брюс [R-AR] Векстон, Дженнифер [D-VA] Уайлд, Сьюзен [D-PA] Уильямс, Никема [D-GA] Уильямс, Роджер [R-TX] Уилсон, Фредерика С. .[D-FL] Уилсон, Джо [R-SC] Виттман, Роберт Дж. [R-VA] Вомак, Стив [R-AR] Райт, Рон [R-TX] Ярмут, Джон А. [D-KY] Янг , Дон [R-AK] Зелдин, Ли М. [R-NY] Любой член Сената Болдуин, Тэмми [D-WI] Баррассо, Джон [R-WY] Беннет, Майкл Ф. [D-CO] Блэкберн, Марша [ R-TN] Блюменталь, Ричард [D-CT] Блант, Рой [R-MO] Букер, Кори А. [D-NJ] Бузман, Джон [R-AR] Браун, Майк [R-IN] Браун, Шеррод [ D-OH] Берр, Ричард [R-NC] Кантвелл, Мария [D-WA] Капито, Шелли Мур [R-WV] Кардин, Бенджамин Л. [D-MD] Карпер, Томас Р. [D-DE] Кейси , Роберт П., младший [D-PA] Кэссиди, Билл [R-LA] Коллинз, Сьюзен М. [R-ME] Кунс, Кристофер А. [D-DE] Корнин, Джон [R-TX] Кортес Масто, Кэтрин [D -NV] Коттон, Том [R-AR] Крамер, Кевин [R-ND] Крапо, Майк [R-ID] Круз, Тед [R-TX] Дейнс, Стив [R-MT] Дакворт, Тэмми [D-IL ] Дурбин, Ричард Дж. [D-IL] Эрнст, Джони [R-IA] Файнштейн, Дайэнн [D-CA] Фишер, Деб [R-NE] Гиллибранд, Кирстен Э. [D-NY] Грэм, Линдси [R -SC] Грассли, Чак [R-IA] Хагерти, Билл [R-TN] Харрис, Камала Д. [D-CA] Хассан, Маргарет Вуд [D-NH] Хоули, Джош [R-MO] Генрих, Мартин [ D-NM] Хикенлупер, Джон У.[D-CO] Хироно, Мэйзи К. [D-HI] Хувен, Джон [R-ND] Хайд-Смит, Синди [R-MS] Инхоф, Джеймс М. [R-OK] Джонсон, Рон [R-WI ] Кейн, Тим [D-VA] Келли, Марк [D-AZ] Кеннеди, Джон [R-LA] Кинг, Ангус С.-младший [I-ME] Клобучар, Эми [D-MN] Лэнкфорд, Джеймс [ R-OK] Лихи, Патрик Дж. [D-VT] Ли, Майк [R-UT] Леффлер, Келли [R-GA] Лухан, Бен Рэй [D-NM] Ламмис, Синтия М. [R-WY] Манчин , Джо, III [D-WV] Марки, Эдвард Дж. [D-MA] Маршалл, Роджер [R-KS] МакКоннелл, Митч [R-KY] Менендес, Роберт [D-NJ] Меркли, Джефф [D-OR ] Моран, Джерри [R-KS] Мурковски, Лиза [R-AK] Мерфи, Кристофер [D-CT] Мюррей, Пэтти [D-WA] Оссофф, Джон [D-GA] Падилья, Алекс [D-CA] Пол , Рэнд [R-KY] Питерс, Гэри С.[D-MI] Портман, Роб [R-OH] Рид, Джек [D-RI] Риш, Джеймс Э. [R-ID] Ромни, Митт [R-UT] Розен, Джеки [D-NV] Раундс, Майк [R-SD] Рубио, Марко [R-FL] Сандерс, Бернард [I-VT] Сассе, Бен [R-NE] Шац, Брайан [D-HI] Шумер, Чарльз Э. [D-NY] Скотт, Рик [R-FL] Скотт, Тим [R-SC] Шахин, Жанна [D-NH] Шелби, Ричард С. [R-AL] Синема, Кирстен [D-AZ] Смит, Тина [D-MN] Стабеноу, Дебби [D-MI] Салливан, Дэн [R-AK] Тестер, Джон [D-MT] Тьюн, Джон [R-SD] Тиллис, Томас [R-NC] Туми, Патрик [R-PA] Тубервиль, Томми [R -AL] Ван Холлен, Крис [D-MD] Уорнер, Марк Р.[D-VA] Уорнок, Рафаэль Г. [D-GA] Уоррен, Элизабет [D-MA] Уайтхаус, Шелдон [D-RI] Уикер, Роджер Ф. [R-MS] Уайден, Рон [D-OR] Янг , Тодд [R-IN]

    Международный аэропорт Балтимора/Вашингтона [BWI] — Путеводитель по терминалам

    Международный аэропорт Балтимора/Вашингтона (BWI) — самый загруженный аэропорт, обслуживающий столичный район Балтимор-Вашингтон, округ Колумбия.

    BWI является основным городом для Southwest Airlines, причем авиакомпания занимает исключительно залы A и B. служить на У.С. Верховный суд.

    Краткая информация

    Аэропорт: Международный аэропорт Балтимора/Вашингтона (BWI)
    Терминалы: 1 терминал с 5 залами – A, B, C, D и E
    Адрес аэропорта:

    Расстояние от центра города 900 Baltimore: примерно 10 миль (16 км)
    сайт: BWIAIRPORT. международные направления
    Информация о рейсах: Информацию о вылетах и ​​прибытиях можно посмотреть здесь

    Авиакомпании, выполняющие рейсы из BWI

    Карта маршрутов международного аэропорта Балтимор/Вашингтон.Изображение предоставлено: Международный аэропорт Балтимора/Вашингтона имени Тургуда Маршалла и OpenStreetMap

    Полезный совет: BWI имеет полезный инструмент поиска, чтобы проверить, в какие пункты назначения вы можете лететь из аэропорта и авиакомпаний, выполняющих маршрут.

    Терминал аэропорта BWI

    BWI имеет главное здание терминала и 5 вестибюлей. Терминал имеет U-образную форму с гаражом в центре и системой дорог аэропорта и службами наземного транспорта, окружающими гараж.

    Зона продажи билетов расположена на верхнем уровне вместе с контрольно-пропускными пунктами, ведущими в вестибюли контролируемой зоны. Главное здание терминала состоит из 2-х уровней.

    Верхний уровень терминала

    Верхний уровень терминала международного аэропорта Балтимор/Вашингтон. Изображение предоставлено: Международный аэропорт Балтимора/Вашингтона имени Тергуда Маршалла

    . На верхнем уровне здания главного терминала расположены билетные кассы и несколько ресторанов и кафе, в том числе Sky Azure, со смотровой галереей.

    Пассажиры могут попасть на верхний уровень прямо из гаража с почасовой оплатой, пройдя через надземные переходы, или со стороны нижнего уровня, воспользовавшись лифтом или эскалаторами.

    Доступ к 4 контрольно-пропускным пунктам осуществляется с верхнего уровня, 3 контрольно-пропускных пункта доступны для залов A, B и C и 1 для залов D. Имейте в виду, что залы D и E не связаны контролируемой зоной с залами A, B и C.

    Нижний уровень терминала

    Международный аэропорт Балтимор/Вашингтон, нижний уровень терминала.Изображение предоставлено: Международный аэропорт Балтимора/Вашингтона имени Тергуда Маршалла

    Залы прибытия во все залы расположены на нижнем уровне, а залы прибытия международных рейсов расположены рядом с залом E.

    На этом уровне расположены несколько кафе и магазинов, а также зал ожидания USO. На нижний уровень терминала можно попасть с почасовой парковки через подземный туннель, а наземный транспорт расположен за пределами зданий терминала в специально отведенных местах.

    Залы ожидания A, B и C

    Международный аэропорт Балтимора/Вашингтона Залы ожидания A, B и C.Изображение предоставлено: Международный аэропорт Балтимора/Вашингтона имени Тергуда Маршалла

    Зал ожидания A имеет 11 выходов, пронумерованных от A1 до A11, а зал B имеет 14 выходов, пронумерованных от B2 до B15. Рейсы из обоих залов выполняются исключительно Southwest Airlines.

    Зал C имеет 14 выходов на посадку, пронумерованные от C1 до C14, с рейсами, выполняемыми Southwest Airlines, American Airlines и Contour Airlines.

    В 3 вестибюля можно попасть из любого из 3 контрольно-пропускных пунктов, расположенных на одной стороне здания аэровокзала, и во всех есть хороший выбор магазинов, баров и ресторанов.

    Залы D и E

    Международный аэропорт Балтимор/Вашингтон Залы D и E. Изображение предоставлено: Международный аэропорт Балтимора/Вашингтона Тергуд Маршалл

    Зал D имеет 20 выходов, пронумерованных от D1 до D5, D7, D8, D10 до D16, D20 до Д26 и Д29. Многие авиакомпании работают из зала D, в том числе Alaska Airlines, Boutique Air и Spirit Airlines.

    Зал D доступен через контрольно-пропускной пункт D/E, поэтому пассажиры имеют доступ к удобствам залов D и E.Клуб в BWI расположен в зале D рядом с выходом на посадку D10, а тренажерный зал Roam Fitness находится сразу после контрольно-пропускного пункта. Если вы летите Southwest или American, вы не сможете получить доступ в Club на BWI, не пройдя контроль безопасности в залах D или E, так что имейте это в виду, если вы хотите посетить зал ожидания.

    Зал E — главный международный зал с рейсами British Airways, Condor и Southwest Airlines. В вестибюле есть 5 выходов с номерами E1, E3, E4, E6 и E8, а также небольшой выбор кафе и ресторанов (больше доступно для пассажиров в зале D).

    Зал Chesapeake Club Lounge предназначен для пассажиров British Airways Club World и расположен на верхнем уровне.

    Inter-Terminal Transport

    Walking

    Международный аэропорт Балтимора/Вашингтона не является огромным аэропортом, поэтому нет поездов или шаттлов в контролируемой зоне для стыковок . Пассажиры должны пройти от главного терминала до своего вестибюля, а при переходе между залами A/B/C и залами D/E они должны повторно пройти проверку безопасности.

    BWI продвигает свои пешеходные маршруты для кардиотренировок вокруг аэропорта (с дефибрилляторами на маршруте) и имеет 2 маршрута протяженностью 1 км — 1 с любого конца главного терминала и 1, который проходит по всей длине от зала A до зала B.

    Baltimore/ Кардиотренировка в международном аэропорту Вашингтона. Изображение предоставлено: Международный аэропорт Балтимора/Вашингтона имени Тургуда Маршалла

    Безопасность и таможня в BWI

    BWI имеет 4 контрольно-пропускных пункта: 3 из них обеспечивают доступ пассажиров в залы A, B и C и 1 в залы D и E.

    • Контрольно-пропускной пункт A : с 3:45 до 20:00.
    • Контрольно-пропускной пункт B : с 3:45 до 21:45.
    • КПП C : с 3:45 до 21:30
    • КПП D/E : с 3:45 до 21:15

    Подсказка: Аэропорт заявляет, что в зависимости от количества пассажиров любой из контрольно-пропускных пунктов A, B или C может быть закрыт для повышения эффективности на открытых контрольно-пропускных пунктах.

    TSA PreCheck

    BWI имеет выделенные полосы TSA PreCheck на каждом контрольно-пропускном пункте, который работает в эти часы:

    • Контрольно-пропускной пункт A : Открыт только в случае необходимости
    • Контрольно-пропускной пункт B

      : 3:44м. до 21:45
    • КПП C : с 3:45 до 21:30
    • КПП D/E : с 3:45 до 21:00

    Global Entry

    У BWI есть киоски Global Entry для пассажиров, имеющих право на участие, которые были одобрены в рамках программы.

    Кандидаты, получившие условное одобрение, могут записаться на собеседование в регистрационный центр BWI, расположенный на нижнем уровне международного терминала. Центр регистрации открыт с понедельника по пятницу, 13:00.м. до 16:00

    BWI также участвует в регистрации по прибытии, и условно утвержденные заявители могут пройти собеседование по прибытии в BWI. Регистрация по прибытии обрабатывается с понедельника по пятницу в 13:00. до 16:00

    Важный совет:  Ищете дополнительную информацию о Global Entry? Это наиболее часто задаваемые вопросы и ответы наших экспертов.

    Мобильный паспорт

    BWI принимает мобильный паспортный контроль для международных рейсов, прибывающих в США.S.

    После того, как пассажиры прибудут в BWI, они должны заполнить информацию о «новой поездке» в приложении и предъявить свой паспорт и электронную квитанцию ​​​​агенту CBP.

    Программа Clear Security

    Проходы CLEAR доступны на каждом контрольно-пропускном пункте BWI вместе с возможностью зарегистрироваться. Они открыты ежедневно:

    • Контрольно-пропускной пункт A : с 4:00 до 19:30.
    • Контрольно-пропускной пункт B, C, D, E : с 4:00 до 21:00.

    Залы ожидания BWI в аэропорту

    У BWI есть несколько залов ожидания для пассажиров, и один из них — фитнес- и велнес-центр.Только в 1 стандартном зале ожидания пассажиры могут приобрести дневной абонемент (The Club на BWI), а клубный лаундж Chesapeake доступен только для пассажиров British Airways Club World.

    Lounge 4 Местоположение 5 4 Дневной проход плата на человека ** Дневной пас.
    Chesapeake Club Lounge (British Airways Club World) уровень Ежедневно: 6 р.м. до 9 вечера N/A
    The Club на BWI Зал D, возле выхода D10 Ежедневно: с 4:30 до 19:00. 40 долларов США
    Roam Fitness Вестибюль D/E, возле выхода D1 Ежедневно: с 6:00 до 16:00. 25 долларов США
    USO Lounge Главный терминал, нижний уровень (вне зоны безопасности) Ежедневно: с 6:00 до 22:00. Н/Д

    *Часы работы могут быть изменены без предварительного уведомления.Доступ в зал ожидания иногда может быть ограничен из-за вместимости.
    **Дневной проездной для любого пассажира. Залы ожидания, помеченные как N/A, разрешают вход только соответствующим требованиям пассажирам в салонах премиум-класса, программах для часто летающих пассажиров или участвующих в программах кредитных карт.

    Подсказка: Хотите не платить за дневной абонемент? Это лучшие кредитные карты, которые дают вам бесплатный доступ в лаундж.

    Доступ к Priority Pass

    Пассажиры допускаются в The Club на BWI за 3 часа до вылета рейса по Priority Pass, при условии наличия мест.

    В зале C также есть Minute Suites, где можно остановиться на 1 час. Minute Suites находится в вестибюле примерно на полпути слева от вас.

    Узнайте больше о членстве в Priority Pass и лучших кредитных картах, которые дают пассажирам бесплатный Priority Pass.

    Рестораны и напитки в аэропорту BWI

    В BWI есть 60 ресторанов, кафе и закусочных, некоторые из которых расположены за пределами охраняемой зоны в северной части терминала. Поскольку залы A, B и C связаны между собой, пассажиры могут свободно перемещаться между ресторанами, расположенными в охраняемой зоне каждого зала.

    Пассажиры могут планировать, где есть и пить, просматривая доступные закусочные на веб-сайте аэропорта.

    BWI Wi-Fi и зарядные станции

    Высокоскоростной Wi-Fi доступен на всей территории аэропорта для всех гостей при подключении к сетевой услуге «_BWI Free WiFi». Гости могут обращаться по адресу [email protected] по любым вопросам подключения или поддержки.

    Зарядные станции: Бесплатные зарядные станции можно бесплатно использовать в вестибюлях.

    Подсказка:  Если во время путешествия вы обнаружите, что у вас нет доступа к Wi-Fi, проверьте лучшие мобильные точки доступа Wi-Fi, чтобы быть всегда на связи.

    BWI Airport Lost and Found

    Если пассажир потерял предмет в самолете, в зоне продажи билетов или на посадке, он должен связаться с соответствующей авиакомпанией.

    В случае потери каких-либо предметов на контрольно-пропускном пункте пассажирам необходимо связаться с отделом бюро находок TSA по телефону 410-689-3620 или посетить офис на нижнем уровне терминала напротив двери 9.

    В случае утери предметов в любом другом месте районах, пассажиры должны подать претензию в офис бюро находок аэропорта или по электронной почте [email protected].Пассажиры также могут посетить бюро находок, расположенное у входа в зал C на верхнем уровне.

    Дополнительная информация об аэропорте

    Информационные службы

    BWI имеет информационные стойки, расположенные по адресу:

    • Зона продажи билетов перед залами A/B и D
    • Зоны выдачи багажа 1-5 Southwest Airlines
    • Нижний уровень залов C и D
    • Зона прибытия международного зала

    Детские игровые площадки

    Детская игровая площадка международного аэропорта Балтимор/Вашингтон.Изображение предоставлено: Международный аэропорт Балтимора/Вашингтона имени Тергуда Маршалла

    К сожалению, BWI не входит в десятку лучших аэропортов США для детей; однако у него есть детская игровая площадка, расположенная в разъеме D / E, с большим самолетом и креслами-качалками.

    Услуги для детей

    BWI имеет посты медсестер в каждом вестибюле. Эти агрегаты Mamava расположены находятся по адресу:

    • Начём возле ворот A7
    • CONUTRE B возле ворот B2
      возле Gate C5
      возле Gate C5 возле Gate D2
    • D / E разъем  в детской игровой зоне

    Путешествие с домашним животным

    Хотя BWI не входит в десятку лучших аэропортов, где разрешено размещение с домашними животными, у BWI есть зоны помощи домашним животным, расположенные внутри и снаружи охраняемых зон:

    • Наружная дверь 19, рядом с Международным терминалом (внешняя охрана)
    • Перед гаражом с почасовой оплатой (внешняя охрана)
    • У входа в зал C (внутренняя охрана)
    • В переходе D/E сразу за охраной (внутри охрана)

    Duty Free

    У BWI есть 2 магазина беспошлинной торговли, расположенные в коннекторах B/C и D/E.

    Места для курения

    Курение разрешено только в специально отведенных местах за пределами зданий аэровокзала. Они расположены в пределах центральных островов на верхнем и нижнем уровнях.

    Молитва

    В BWI есть комната для медитации, которую можно использовать для молитвы и тихого размышления. Комната расположена за билетной кассой Delta, и пассажиры могут попасть в комнату, позвонив по телефону 410-859-7736.

    Деньги

    BWI имеет 2 пункта обмена валюты: 1 расположен на верхнем уровне главного терминала, рядом с билетной кассой American Airlines, а другой находится в соединителе D/E.

    Банкоматы расположены по всему аэропорту.

    BWI Важные номера телефонов

    Информация: 410-859-7111

    Утерянные и найденные: 410-859-7387

    Парковка: 800-468-6294

    Путешествия в Аэропорт BWI 9002

    Опции

    Поезд
    • Amtrak : Для поездок в Филадельфию, Вашингтон, округ Колумбия, Уилмингтон, штат Делавэр, и в другие места пассажиры могут воспользоваться бесплатным маршрутным автобусом от BWI до станции MARC/Amtrak.Шаттлы до аэропорта отправляются с нижнего уровня за пределами зоны выдачи багажа каждые 10 минут (за исключением периода с 1:00 до 5:00, когда рейс осуществляется каждые 25 минут).
    • Поезд MTA MARC : Поезда MARC отправляются со станции MARC/Amtrak, расположенной недалеко от аэропорта. Поскольку станция такая же, как станция Amtrak, применяется информация о трансфере до аэропорта, как указано выше.
      • Службы работают в / из центра Балтимора, округа Принс-Джордж, округа Харфорд, Вашингтон, округ Колумбия.С., и многое другое.
    • Легкорельсовый транспорт MTA : Пассажиры могут доехать на легкорельсовом транспорте от BWI до центра Балтимора, Тимониума и Хант-Вэлли, а также до станции Penn Station. Стоимость проезда в один конец составляет 1,90 доллара США.
      • Станция легкорельсового транспорта расположена рядом с залом E на нижнем уровне за пределами терминала. Поезда ходят с понедельника по пятницу с 4:45 до 00:40, в субботу с 5:05 до 00:45, а по воскресеньям и в праздничные дни с 10:35.м. до 20:40
    Автобус
    • Автобус MTA ICC : Автобусный маршрут 201 курсирует в/из BWI от Gaithersburg Park and Ride, с остановками у Shady Grove Metro, Georgia Avenue Park and Ride и Arundel Mills Mall. Маршрут 201 курсирует снаружи здания терминала возле залов A и E, высаживая пассажиров на верхнем уровне и забирая их с нижнего уровня.
      • Автобусы ходят каждый час по будням с 5:05 до 23:05. и с 9:05 ч.м. до 23:05 в выходные и праздничные дни.
    • Автобус MTA : Маршрут 75 курсирует между аэропортом и центром Parkway, аэропортом 100, торговым центром Arundel Mills, парком и остановкой легкорельсового транспорта Patapsco. Маршрут 107 — это автобус, курсирующий по будням в часы пик, который курсирует между BWI и станцией метро Old Court.
    • RTA : Route 501/Silver проходит от торгового центра Columbia Mall до аэропорта через округ Энн Арундел и округ Северный Принс-Джордж. Услуга работает ежедневно и стоит 2 доллара за поездку.
    • WMATA : Автобус B30 Express Metro курсирует между BWI и станцией метро Greenbelt. Автобусы отправляются ежечасно с нижнего уровня за пределами залов A/B и E по будням с 6:30 до 21:33.
    Маршрутные автобусы
    Международный аэропорт Балтимора/Вашингтона останавливаются. Изображение предоставлено: Международный аэропорт Балтимора/Вашингтона имени Тергуда Маршалла

    BWI имеет специальные остановки для бесплатных шаттлов, чтобы управлять движением транспортных средств:

    • Зоны 1 и 3 : Шаттлы отелей
    • Зона 2 : Шаттлы для парковки вне аэропорта
    • Зона 4 : Гостиницы и шаттлы на стоянке вне аэропорта

    BayRunner Shuttle : Пассажиры могут заказать этот рейсовый микроавтобус, который регулярно курсирует между Оушен-Сити и Грантсвиллем, по пути останавливаясь в аэропорту.

    Такси

    Стоянки такси находятся за дверями 5 и 13 на нижнем уровне терминала. Такси в аэропорту не могут взимать фиксированную ставку, но примерная ставка по счетчику до центра Балтимора составляет 35 долларов, а до центра Вашингтона, округ Колумбия, — 90 долларов.

    Службы поездок

    Службы поездок на основе приложений, такие как Uber или Lyft, могут забирать и высаживать пассажиров на обочине на верхнем уровне терминала.

    Как добраться на автомобиле

    Прибытие из центра Балтимора

    Следуйте по шоссе MD 205 South, затем сверните на I-195 East в направлении аэропорта BWI.Продолжайте движение по I-195, пока не доберетесь до дорожной системы аэропорта.

    Прибытие из Вашингтона, округ Колумбия

    Двигайтесь по Нью-Йорк-авеню/US-50, затем поверните на две полосы налево в сторону Балтимор-Вашингтон-Паркуэй. Выезжайте на Baltimore-Washington Parkway и продолжайте движение до съезда I-195 East в направлении аэропорта BWI. Продолжайте движение по I-195, пока не доберетесь до дорожной системы аэропорта.

    BWI Информация о парковке автомобилей

    Международный аэропорт Балтимора/Вашингтона карта парковки. Изображение предоставлено: Международный аэропорт Балтимора/Вашингтона имени Тергуда Маршалла

    Официальная парковка аэропорта
    Краткосрочная парковка

    Гараж с почасовой оплатой предлагает ближайшую и наиболее удобную парковку к главному зданию терминала.

    В гараже используется технология интеллектуальной парковки, которая направляет водителей к месту с зеленым светом, а припарковавшись, пассажиры могут попасть в терминал через мосты с климат-контролем. Стоимость парковки составляет 4 доллара США в час и 22 доллара США в день .

    Долгосрочная парковка

    Ежедневная парковка Гараж расположен на Terminal Road и Scott Drive напротив экспресс-стоянки. Шаттлы курсируют между гаражом и аэропортом каждые 8-10 минут. Ежедневная парковка стоит 12 долларов .

    Экспресс-стоянка — второй по дешевизне вариант, доступный в BWI по цене 10 долларов в день .

    После того, как пассажиры припаркуются, маршрутный автобус заберет вас и ваш багаж с парковки и отвезет в здание терминала. Экспресс-участок расположен напротив ежедневного гаража на Терминал-роуд и Скотт-драйв.

    Долгосрочная парковка A и B парковочных мест предлагают наиболее экономичную парковку в аэропорту ( $8 в день) и расположены по адресу MD 162 (Авиационный бульвар) между S.Кэмп-Мид-роуд и Андовер-роуд. Между аэропортом и парковками курсируют бесплатные шаттлы.

    Парковка для посадки или высадки пассажиров

    Посетители, встречающие пассажиров, могут пользоваться мобильным телефоном, пока пассажир не будет готов к встрече на обочине. Посетители могут ждать на стоянке до 1 часа и не могут покидать свои автомобили в течение этого времени.

    Стоянка ожидания сотового телефона расположена на Скотт-роуд, рядом с ежедневным въездом в гараж.

    Внешняя парковка и парковка в отеле

    Довольно стандартно иметь возможность получить более дешевую парковку в аэропорту с парковкой за пределами территории, но с BWI экономия невелика!

    Ежедневная парковка стоит около 7 долларов США при бронировании на стороннем сайте, таком как airportparkingreservations.ком. Поскольку официальная долгосрочная парковка доступна всего на 1 доллар в день больше, мы считаем, что стоит сэкономить на поездке и парковке на территории аэропорта (если вы не бронируете отель и парковку).

    Парковка для пассажиров с ограниченными возможностями

    Парковка для инвалидов доступна на всех официальных парковках аэропорта, а все автобусы-шаттлы приспособлены для инвалидных колясок.

    Контактный номер парковки:

    Общие вопросы парковки: 800-468-6294

    Пункт проката автомобилей в BWI

    Центр проката автомобилей BWI расположен на территории аэропорта, недалеко от терминала.Бесплатные шаттлы доставляют пассажиров в/из центра проката автомобилей и отправляются с нижнего уровня терминала.

    Поездка на шаттле между пунктом проката автомобилей и терминалом занимает 10 минут, так как объект расположен на Stoney Run Road и New Ridge Road.

    Эти компании по аренде автомобилей базируются на объекте:

    Подсказка: Чтобы не платить дорогую страховку через агентство по аренде, ознакомьтесь с этими кредитными картами, которые включают страховку при аренде автомобиля в качестве преимущества.

    Гостиницы аэропорта BWI Hilton Baltimore Аэропорт BWI. Изображение предоставлено: Hilton

    Хотя на территории аэропорта нет отелей, в радиусе 3 миль есть хороший выбор 3- и 4-звездочных отелей, а ближайший кластер отелей расположен всего в 2 км.

    Аэропорт отелей

    Отели

    2 Расстояние от аэропорта (миль)

    4 2

    -2333

    Hotel Адрес / Телефон Адрес / Телефон 7
    Aloft Bwi Baltimore Washington International Airport 1741 Вт.Питомник Rd., Linthicum Heights, MD 21090

    410-691-6969

    3 1 2 4 1.2
    Hilton Baltimore BWI Airport 1739 W. Netwerre Rd., Linthicum Heights, MD 21090

    410-694-0808

    3 3 1.2 1.2
    Holiday Inn Baltimore BWI Аэропорт площадью 815 Elkridge посадка RD., Linthicum Heads, MD 21090

    410-691-1000

    3 4 1,3
    BWI Airport Marriort 1743 Вт.Питомник RD., ЛИНГИКУМ ВЫСОКИ, MD 21090

    410-859-8300

    3 1.4 4 1.4
    Country Inn & Suites от Radisson, BWI Airport (Baltimore), MD 1717 W. Netwerry Rd., Linticum Высоты, MD 21090

    443-577-1036

    1.4 1.4 4 1,4
    La Quinta от Wyntham Baltimore BWI Airport 1734 W. W. Netwerry Rd., Linthicum Heights, MD 21090

    410-859-2333

    3 1.5
    Red Book Inn Plus + Baltimore-Washington DC / BWI Airport 827 Elkridge посадка RD., ЛИНГИКУМ ВЫСОКИЙ, MD 2109

    410-850-7600

    2 2 4 1.5
    двор Marriott Baltimore BWI Airport 1671 W. Networks Rd., Линтхикум высоты, MD 21090

    410-859-8855

    -8855

    3 1.6
    Fairfield Inn & Suites Baltimore BWI Airport 1020 Andover Rd., Linthicum Heights, MD 21090

    410-691-1001

    3 1,6 4 1.6
    410-684-6100

    410-684-6100

    3 1 1.7 1,7
    SONESTA ES SUITES BALTIMORE BWI Airport 1160 Winternon Rd., ЛИНХИКУМ ВЫСОКИЙ, MD 21090

    410-691-0255

    3 1,7
    Springhill Suites Baltimore BWI Аэропорт 899 Elkridge Landing Rd., Linthicum Heights, MD 21090

    410-694-0555 410-694-0555

    3 1,7 1.7
    Towneplace Suites от Marriott Baltimore BWI Airport 1171 Winternon RD., Linticum Heights, MD 21090

    910-694-0060

    3 3 1.7 1,7
    Doubletree от Hilton Baltimore — BWI Airport 890 Elkridge посадки RD., Linthicum Heights, MD 2109

    410-859-8400

    3 1.8
    Microtel Inn Wyndham BWI Airport 1170 Winterson Rd., Linthicum heights, md 21090

    410-449-4357

    3 1,8 1.8 4 1.8 4 1.8
    Расширенное пребывание Америки — Baltimore — BWI Аэропорт — Международный доктор 939 Международный доктор, Linthicum Heights, MD 21090

    410 691-2500

    2 2 2 1.9 1,9 0
    SONESTA SOUTE SULLES BALTIMORE BWI Airport 1247 WINTERSON RD., LINTICUM HEESTS, MD 21090

    410-850-9214

    2 2
    Hyatt Place Baltimore/BWI Airport 940 International Dr., Linthicum Heights, MD 21090

    410-859-3366

    3 2 4 2
    0
    Hilton Garden Inn Inn BWI Airport 1516 Aero Dr., Linticum Heights, MD 21090

    410-691-0500

    3 2.1 2.1
    Beactbridge Suites Baltimore BWI Airport 1301 Winternson RD., ЛИНХИКУМ, MD 21090

    410-850-5666

    410-850-5666

    3 4 2.1
    Subssy Suites Baltimore — в аэропорту BWI 1300 Зал Dr., Linthicum heights, md 21090

    410-850-0747 410-850-0747

    4 4 2.2 2 4 2.2
    Расширенное пребывание Америки — Балтимор — BWI Air Aero Dr. 1500 Aero Dr., Linthicum Heights, MD 21090

    410-850 -0400

    2 2 2 2.2
    Holiday Inn Express & Suites Baltimore — BWi Airport North 1510 Aero Dr., Linthicum Heights, MD 21090

    410-859-0003

    3 22
    Sheraton Baltimore Washington Airport – BWI 1100 Old Elkridge Landing Rd., Linthicum Heights, MD 21090

    443-577-2100

    4 4 2 2 2
    Аэропорт Westin Baltimore Washington — BWI 1110 Старый Elkridge посадки RD., ЛИНХИКУМ ВЫСОКИЙ, MD 21090

    443-577-2300

    4 4 4 2 2.2
    Holiday Inn Express Baltimore BWI Airport West 7481 Ridge Rd., Ганновер, MD 21076

    410-684-3388

    2 4 2.6
    Comfort Inn & Suites BWI Airport 6921 Baltimore Annapolis Blvd., Балтимор, MD 21225

    443-856-2529

    3 2.9
    Fairfield Inn & Suites от Marriott Arundel Mills BWI Airport 7539 Teague Rd., Ганновер, MD 21076

    410-694-9500

    3 3 2.9 29 0
    Home2 Suites от Hilton Arundel Mills BWI Airport 7545 Teague Rd., Ганновер, MD 21076

    410-684-2003

    3 29
    Sleep Inn & Suites Аэропорт BWI 6055 Belle Grove Rd., Baltimore, MD 21225

    443-856-2479

    9066-2479

    3 29

    Top 3 Hotel Lists Использование очков

    Адрес и телефон 5 9
    Hotel Звездный рейтинг Расстояние от аэропорта (миль) Программа лояльности Point Redemption Стоимость 7
    Аэропорт Уэстина Балтимора Вашингтон — BWI 1110 Старый Elkridge посадка Rd., Linthicum Heights, MD 21090

    443-577-2300

    4 4 2 2.2 2 Marriott Bonvoy 20 000 до 30 000 очков Marriott
    Doubletree от Hilton Baltimore — BWI Airport 890 Elkridge посадка RD., Linthicum Высоты, MD 2109

    410-859-8400

    3 1,8 1.8 1,8 Hilton Poinous 25 000 до 30 000 Hilton Conous Points
    HYATT Place Baltimore / BWI Airport 940 International Dr., Linthicum heights, MD 21090

    410-859-3366

    2 2 2 2 2 2 5 2 5 3500 до 6500 Мир Hyatt Points

    Westin Baltimore Chassialton Airporth — BWI менее чем 4,8 км от международного аэропорта Балтимор/Вашингтон. Для вашего удобства предоставляется бесплатный трансфер от/до аэропорта. В отеле также есть фитнес-центр и крытый бассейн. Участники Marriott Bonvoy со статусом Platinum Elite или выше могут насладиться бесплатным завтраком в представительском лаундже .При расценках Marriott Bonvoy в пиковые и непиковые часы необходимое количество баллов будет в значительной степени зависеть от времени года, которое вы посещаете: непиковых дат по 20 000, стандартных дат по 25 000 и пиковых дат по 30 000 баллов за ночь.

    Отель DoubleTree by Hilton предлагает непосредственную близость к аэропорту, бесплатный трансфер, собственный ресторан, открытый бассейн и круглосуточный фитнес-центр. Что касается премиальных ночей, имейте в виду, что Hilton больше не публикует таблицу премий и использует динамическую модель ценообразования для всех своих отелей.Ночь в этом отеле часто стоит от 25 000 до 30 000 баллов за ночь.

    Все гости отеля Hyatt Place Baltimore/BWI Airport могут воспользоваться крытым бассейном, круглосуточным фитнес-центром, баром/гостиной, бесплатным трансфером от/до аэропорта и бесплатным завтраком. Более того, отель относится к категории 1 в программе World of Hyatt, поэтому стоит всего от 3500 до 6500   баллов  за бесплатную ночь!

    Если вы хотите накопить баллы, чтобы остаться в одном из этих вариантов, ознакомьтесь с нашими руководствами о том, как лучше всего заработать больше баллов World of Hyatt, Marriott Bonvoy или Hilton Honors.

    Заключительные мысли

    Учитывая, что Southwest Airlines обеспечивает 67% пассажиропотока BWI, неудивительно, что аэропорт недавно расширил свой терминал А на сумму 60 миллионов долларов. Расширение, открывшееся в мае 2021 года, включает в себя 5 новых ворот, новые туалеты, розничные магазины и рестораны.

    BWI ранее входил в десятку лучших аэропортов США по версии журнала Condé Nast Traveler’s Readers’ Choice в 2018 году. Награда была получена благодаря удобному транзитному доступу к аэропорту, эффективности и удобствам, таким как прокат велосипедов для сопровождения 12-мильной велосипедной дорожки вокруг аэропорта, рестораны и смотровая площадка.

    Оставить ответ