Лампа габаритная лада гранта: Лада Гранта — лампы, применяемые в автомобиле — журнал За рулем

Содержание

Лада Гранта — лампы, применяемые в автомобиле — журнал За рулем

От исправности внешних световых приборов вашего автомобиля зависит безопасность — не только ваша и ваших пассажиров, но и других участников дорожного движения. Вот почему крайне важно знать, какие лампы предусмотрены производителем для установки в световых приборах вашей Лада Гранта, и уметь в случае необходимости их заменить.

Из соображений безопасности водителей, пассажиров и пешеходов Правилами дорожного движения и Техническим регламентом о безопасности колесных транспортных средств запрещена эксплуатация автомобилей, внешние световые приборы которых не соответствуют требованиям конструкции данного транспортного средства. Ведь, с одной стороны, необходимо, чтобы автомобиль был хорошо виден на дороге, а с другой — опасно ослепить других водителей или пешеходов слишком ярким или неправильно настроенным светом фар. Работающие стоп-сигналы позволят держать безопасную дистанцию двигающимся за вами водителям. Таких нюансов множество, и каждый может сберечь не только средства и нервы, но часто и здоровье.

===

Лампы, применяемые в автомобиле Лада Гранта

Лампы, применяемые в автомобиле Лада Гранта

Лампы, применяемые в автомобиле Лада Гранта

[14 операций по техобслуживанию Lada Granta, которые помогут вам сэкономить]

[Как сэкономить на плановом ТО Lada Granta] [Техническое обслуживание Lada Granta на 2,5 тыс. км пробега] [Техническое обслуживание Lada Granta на 15 000 и 105 000 км пробега] [Техническое обслуживание Lada Granta на 30 000 и 60 000 км пробега] [Техническое обслуживание Lada Granta на 45 тыс. км пробега] [Техническое обслуживание Lada Granta 75 тыс. км пробега] [Техническое обслуживание Lada Granta на 90 тыс. км пробега] [Самостоятельное проведение ТО — общие рекомендации] [Правила техники безопасности при самостоятельном проведении ТО] [Инструмент, необходимый для проведения техобслуживания Lada Granta] 

Наше новое видео

Понравилась заметка? Подпишись и будешь всегда в курсе!

За рулем на Яндекс.Дзен

Page not found — автомануал заказ автокниг с доставкой в любую точку мира

НАШИ ПАРТНЕРЫ:

Любой современный легковой или грузовой автомобиль можно обслуживать и ремонтировать самостоятельно, в обычном гараже. Все что для этого потребуется – набор инструмента и заводское руководство по ремонту с подробным (пошаговым) описанием выполнения операций. Такое руководство должно содержать типы применяемых эксплуатационных жидкостей, масел и смазок, а самое главное – моменты затяжки всех резьбовых соединений деталей узлов и агрегатов автомобиля. Итальянские автомобили – Fiat (Фиат) Alfa Romeo (Альфа Ромео) Lancia (Лянча) Ferrari (Феррари) Mazerati (Мазерати) имеют свои конструктивные особенности. Также в особую группу можно выделить все французские машины – Peugout (Пежо), Renault (Рено) и Citroen (Ситроен). Немецкие машины сложные. Особенно это относится к Mercedes Benz (Мерседес Бенц), BMW (БМВ), Audi (Ауди) и Porsche (Порш), в чуть меньшей — к Volkswagen (Фольксваген) и Opel (Опель). Следующую большую группу, обособленную по конструктивным признакам составляют американские производители- Chrysler, Jeep, Plymouth, Dodge, Eagle, Chevrolet, GMC, Cadillac, Pontiac, Oldsmobile, Ford, Mercury, Lincoln. Из Корейских фирм следует отметить Hyundai/Kia, GM-DAT (Daewoo), SsangYong.

Совсем недавно японские машины отличались относительно низкой первоначальной стоимостью и доступными ценами на запасные части, но в последнее время они догнали по этим показателям престижные европейские марки. Причем это относится практически в одинаковой степени ко всем маркам автомобилей из страны восходящего солнца – Toyota (Тойота), Mitsubishi (Мицубиси), Subaru (Субару), Isuzu (Исудзу), Honda (Хонда), Mazda (Мазда или как говорили раньше Мацуда), Suzuki (Сузуки), Daihatsu (Дайхатсу), Nissan (Ниссан). Ну, а машины, выпущенные под японо-американскими брендами Lexus (Лексус), Scion (Сцион), Infinity (Инфинити), Acura (Акура) с самого начала были недешевыми.

 

Отечественные автомобили также сильно изменились с введением норм евро-3. лада калина, лада приора и даже лада нива 4х4 теперь значительно сложнее в обслуживании и ремонте.

что делать если машина не заводится, как зарядить аккумулятор, как завести машину в мороз. ответы на эти вопросы можно найти на страницах сайта и книг. представленных здесь же

Автомануал — от англ. manual — руководство. Пособие по ремонту автомобиля или мотоцикла. различают заводские руководства и книги , выпущенные специализированными автомобильными издательствами.

Cайт Автомануал не несет никакой ответственности за возможные повреждения техники или несчастные случаи, связанные с использованием размещенной информации.

Page not found — автомануал заказ автокниг с доставкой в любую точку мира

НАШИ ПАРТНЕРЫ:

Любой современный легковой или грузовой автомобиль можно обслуживать и ремонтировать самостоятельно, в обычном гараже. Все что для этого потребуется – набор инструмента и заводское руководство по ремонту с подробным (пошаговым) описанием выполнения операций. Такое руководство должно содержать типы применяемых эксплуатационных жидкостей, масел и смазок, а самое главное – моменты затяжки всех резьбовых соединений деталей узлов и агрегатов автомобиля. Итальянские автомобили – Fiat (Фиат) Alfa Romeo (Альфа Ромео) Lancia (Лянча) Ferrari (Феррари) Mazerati (Мазерати) имеют свои конструктивные особенности. Также в особую группу можно выделить все французские машины – Peugout (Пежо), Renault (Рено) и Citroen (Ситроен). Немецкие машины сложные. Особенно это относится к Mercedes Benz (Мерседес Бенц), BMW (БМВ), Audi (Ауди) и Porsche (Порш), в чуть меньшей — к Volkswagen (Фольксваген) и Opel (Опель). Следующую большую группу, обособленную по конструктивным признакам составляют американские производители- Chrysler, Jeep, Plymouth, Dodge, Eagle, Chevrolet, GMC, Cadillac, Pontiac, Oldsmobile, Ford, Mercury, Lincoln. Из Корейских фирм следует отметить Hyundai/Kia, GM-DAT (Daewoo), SsangYong.

Совсем недавно японские машины отличались относительно низкой первоначальной стоимостью и доступными ценами на запасные части, но в последнее время они догнали по этим показателям престижные европейские марки. Причем это относится практически в одинаковой степени ко всем маркам автомобилей из страны восходящего солнца – Toyota (Тойота), Mitsubishi (Мицубиси), Subaru (Субару), Isuzu (Исудзу), Honda (Хонда), Mazda (Мазда или как говорили раньше Мацуда), Suzuki (Сузуки), Daihatsu (Дайхатсу), Nissan (Ниссан). Ну, а машины, выпущенные под японо-американскими брендами Lexus (Лексус), Scion (Сцион), Infinity (Инфинити), Acura (Акура) с самого начала были недешевыми.

 

Отечественные автомобили также сильно изменились с введением норм евро-3. лада калина, лада приора и даже лада нива 4х4 теперь значительно сложнее в обслуживании и ремонте.

что делать если машина не заводится, как зарядить аккумулятор, как завести машину в мороз. ответы на эти вопросы можно найти на страницах сайта и книг. представленных здесь же

Автомануал — от англ. manual — руководство. Пособие по ремонту автомобиля или мотоцикла. различают заводские руководства и книги , выпущенные специализированными автомобильными издательствами.

Cайт Автомануал не несет никакой ответственности за возможные повреждения техники или несчастные случаи, связанные с использованием размещенной информации.

Лампочки в габариты лада гранта

Здравствуйте дорогие подписчики!

Сегодня я заснял видео о том как заменить лампочки габаритных огней на Лада Гранта,
Они же кстати и Дневные Ходовые огни! ( В магазинах когда искал лампочку, все чуть с ума не сошли… когда я им говорил: » Здравствуйте, у Вас есть светодиодные лампочки, на дневные ходовые огни на Ладу Гранту?»
Не мне приносили лампочки разные, даже до смеха доходило… какие только не несли:)))))

Но дело в том что если продавцу сказать, что тебе лампочки нужны в дневные ходовые огни (ДХО) то они долго не смогут поверить что на Грантах они просто на просто есть! :))
Нужно говорить: «Здравствуйте, дайте мне пожалуйста светодиодные лампочки в ГАБАРИТЫ на Ладу Гранту! )
И так ближе к делу…
Вот видео как они меняются!
Даже триногу для фотика сегодня купил, что бы видео получилось не с дрожащих рук, а по нормальному :)) а вот и тренога …

Так что это видео действительно очень продуманно с моей стороны, много делал попыток снимать самому, просил любимую Племяшку Настюшку, но тринога спасла положение и вот что получилось!

Для нормальной работы системы освещения и световой сигнализации автомобиля Lada Granta применяйте лампы, указанные в руководстве по эксплуатации автомобилем. Стоит отметить, что на обновленном семействе Lada Granta используются новые фары с другими лампами. В таблице указаны категории ламп, которые применяются на новой Гранте и дорестайлинговой версии.

Место установки Новая Granta Старая Granta
Фара
– лампа ближнего/дальнего света h29 h5
– лампа указателя поворота PY21W
– лампа дневного ходового огня и габаритного огня W21/5W
Задний фонарь (для кузова «седан»)
– лампа сигнала торможения и габаритного огня P21/5W
– лампа света заднего хода P21W
– лампа противотуманного огня P21W
– лампа указателя поворота PY21W
Задний фонарь (для кузовов «лифтбек», «хэтчбек» и «универсал»)
– лампа сигнала торможения P21W
– лампа габаритного огня R10W P10W
– лампа света заднего хода W16W
– лампа указателя поворота PY21W
Лампа передней противотуманной фары h26 h21
Лампа бокового указателя поворота WY5W W5W
Лампа освещения номерного знака W5W C5W (седан)
W5W (хэтчбек)
Лампа плафона освещения багажника C5W C5W

Новые лампы h29 и Н18 это эволюция ламп Н4 и Н7. Новые лампы уже заложены к конструкции будущих проектах LADA (подробней). Lada Granta FL – первая модель, в фарах которой начали применять лампы h29.

Вместо новых ламп h29 в фары Lada Granta FL можно установить лампы h5. Перед установкой на лампе h5 следует подогнуть усики:

Светят лампы h29 и h5 одинаково, это подтверждается тестами:

Напомним, ранее мы выкладывали инструкцию по замене ламп в фарах и фонарях Гранты (ближний и дальний свет, ДХО).

Обеспечить безопасность автомобиля и пассажиров в ночное время суток позволяют специальные лампы. Они дают возможность другим участникам дорожного движения увидеть очертания транспорта или оценить расстояние между машинами.

Кроме того данные осветители позволяют выделиться в условиях сильных осадков, тумана. Для современной Гранта Лада габариты устанавливаются в корпусе спереди и сзади, что гарантируют четкую видимость авто среди потока других машин или на безлюдной трассе.

Качественные габариты Гранты: особенности огней

На Ладе не принято устанавливать ДХО, поэтому достойной их заменой можно считать обычные габаритные огни. Они не предназначены для освещения дорожной площадки непосредственно перед автомобилем. По этой причине для Лада Гранта габариты не должны обладать большой яркостью.

Светодиодные аналоги с мощностью в 4/5 Вт (для передних и задних отличаются) отлично подойдут для решения задачи замены.

Задние лампы совмещены в одном блоке со стоп-огнями. Но никаких затруднений при их обновлении не возникает. Самое главное, что должен помнить владелец: в Гранта габариты могут быть как с цоколем, так и без него, в зависимости от места монтажа.

Нужно также учитывать и вольтаж при выборе элементов, иначе они не только не будут корректно работать, но и могут привести к повреждению креплений. Руководствоваться при покупке необходимо данными по штатным огням, указанными в документах на автомобиль.

Как выбрать и заменить габариты Гранта седан?

Приобретать лампы необходимо согласно стандартным для модели маркировкам. Для замены переднего габарита понадобится бесцокольный осветительный элемент W5W с мощностью 21/5 Вт.

Сзади устанавливаются изделия маркировки P21, правда их мощность должна составлять 4 Вт. Чтобы выбрать для Гранта габариты седан можно обратиться в любой автомобильный магазин. При этом покупатель сможет приобрести как стандартные типы, так и более яркие светодиодные аналоги.

ВАЖНО: Иногда, юный автолюбитель может решить, что нужно поставить лампы поярче, что бы его было лучше видно на дороге, ну и просто круто. Делать так не нужно, по одной простой причине. Более яркая (и как следствие мощная) лампа будет выделять больше тепла.

В итоге, начнет плавиться отражатель (и из блестящего превратится в черный), оплавится сам патрон лампы, оплавится защитное «стекло» фары, если оно пластиковое. А так да, первое время будет круто ?

Процедура установки передних габаритов производится довольно легко, но нужно учитывать и аккуратность замены, и правильность монтажа. Передняя лампа габаритов Гранта расположена в блок-фаре и к ней проще всего подобраться из-под капота. Предварительно нужно снять клеммы с аккумулятора.

Подобная предосторожность позволит избежать замыкания контактов и кроме того обезопасит и самого исполнителя. Далее работа по замене передних габаритов производится согласно такой схеме:

1. Отстегиваются крепления на воздушном фильтре, снимается патрубок, коробка воздушного фильтра вытягивается (для левой лампы).

2. Против часовой стрелки выкручивается цоколь лампы и изымается из корпуса.

3. Вытаскивается из цоколя старая лампа и вставляется новая, на место закручивается цоколь, устанавливается в обратном порядке коробка воздушного фильтра.

4. С другой стороны работа по замене потребует снятия защитной крышки двигателя. Далее работа проводится по описанному выше алгоритму.

5. По завершению установки правой габаритной лампы возвращается пластиковая крышка.

По описанной схеме выполнить установку новых огней или же заменить перегоревшую лампу сможет даже новоиспеченный владелец Гранты. Но нужно помнить о последующем подключении клемм и проверке работы оптики.

Обновленные на Lada Granta габариты будут работать исправно только при хорошем зажатии лампы в патроне. Аккуратное проведение работы полностью исключит необходимость повторной проверки соединений.

Проведение установки новых элементов сзади еще проще. В частности задние габариты Гранта вынимаются довольно легко, но предварительно владельцу понадобится убрать коврик багажника, чтобы получить доступ к огням. Далее производится изъятие цоколя (выкручивается против часовой стрелки), удаление старой лампы и установка новой.

Сборка осуществляется в обратном порядке, при этом общий срок замены составит примерно 20-30 минут. Провести операцию самостоятельно при минимальных затратах времени и средств не составит труда.

Лампы | Лады Гранты

Автор Константин На чтение 3 мин. Просмотров 23.3k.

Очень важно для владельцев Лада Гранта знать систему освещения автомобиля и лампы, которые в ней используют. Безопасность вождения напрямую зависит от надежности светового решения модели. Современное разнообразие моделей ламп для Лада Гранта помогают обеспечить повышенную яркость, оптимально осветить дорогу во время движения. Это позволяет своевременно замечать дорожные знаки и препятствия, снизить нагрузку для глаз водителя.

Фары в автомобиле предназначаются для включения во время передвижения и отвечают за ближний и дальний свет.

Электрооборудование автомобиля Лада Гранта в себя включает:

Передние лампы

— 2 фары (головного света и переднюю противотуманную). Подразделяется на секции:

1. света ближнего/дальнего. Обычно в этой секции успешно применяют лампы h5 12 B. Для оснащения света дальнего берут такую лампу мощностью 60 Вт, рекомендация для света ближнего – 55 Вт.

2. сигнализатора поворота. Для этой секции идеально подходит лампа янтарного цвета. Модель PY21W мощностью 21 Вт.

3. ходового дневного (ДХО)/габаритного огня. В данной секции подобраны на основной нити лампы P21/5W 12 В/21 Вт, тип лампы на дополнительной тот же, но с другой мощностью – 5 Вт.

4. Лампу H7 12B мощностью 55 Вт ставят на противотуманную фару 

 

 

 

Задние лампы

— правая и левая фары задние. Включают в себя четыре секции, оснащенные различным типом ламп:

1. Стоп-сигнала и габаритного света. Для этой секции на основной нити применяют обычно лампу P21/5W 12B/21 Вт. Лампу P21/5W 12B/5 Вт – используют на дополнительной (можно взять P21/4W).

2. Сигнализатора поворотов. В секцию рекомендованы лампы янтарного цвета PY21W 12В/21Вт.

3. Сигнализатора заднего хода. Для секции третьей Лада Гранта лучше всего подходит лампа P21W 12 В/21 Вт.

4. Секция с рефлектором. Указатель (сигнализатор) поворота боковой. Устанавливается на Лада Гранта на том же месте, где этот компонент крепится на других моделях Лада, таких как Калина или Приора. Используется лампа с янтарным рассеивателем WSW 12B/5Bт. При установке указателя с рассеивателем белым рекомендуется лампа WY5W 12 В/5 Вт.

Выбираем лампы

Галогенные лампы накаливания приобретают все большую популярность для ламп ближнего света. Их называют лампами повышенного визуального комфорта. Но белый цвет таких ламп приводит к ухудшению видимости при дождливой погоде. Белый свет больше отсвечивает от мокрой поверхности, чем проигрывает перед лампами желтого света.

Не составляет труда приобрести такие марки:

— OSRAM;

— GENERAL Elektrik;

— Philips;

— Narva;

— IPF;

— Hella.

Для Лада Гранта больше рекомендуют выбирать лампы модели OSRAM Н4. Особенно модификации Standard и Light Day. Модель Standard оптимально соответствует перечню всех законодательных требований и норм. Среди всех перечисленных моделей выделяется наиболее высоким показателем значения силы света, что обеспечивает необходимую безопасность.

Также лампа обеспечивает оптимально выдержанные нормы:

— геометрии;

— освещенности;

— точность границы светотени.

Модель Light Day имеет меньшую силу света, но более выгодна по сроку эксплуатации. Для экономии электроэнергии используют светодиодные лампы. Они выпускаются различного цвета. Но, согласно нормам, применять можно белый или желтый цвет. Установка таких ламп на Лада Гранта существенно снижает нагрузку на аккумулятор модели и возможность возникновения ДТП. Светодиоды устойчивы к вибрации, что увеличивает их срок жизни.

Лампы, применяемые на Лада Гранта (ВАЗ-2190, 2191)


Тип (ГОСТ) Тип (ЕЭК )
Передние фары
лампа дальнего света
АКГ 12-60+55
h5
лампа ближнего света
АКГ 12-60+55
h5
лампа указателя поворота
А12-21-4
PY21W
лампа дневного ходового и габаритного огней

W21/5W
Задние фонари (для кузова «седан»)
Лампа сигнала торможения и габаритного огня
А12-21+5-2
P21/5W
Лампа света заднего хода
А12-21-3
P21W
Лампа противотуманного огня
А12-21-3
P21W
Лампа указателя поворота
А12-21-4
PY21W
Задние фонари (для кузова «хэтчбек»)
Лампа сигнала торможения
А12-21-3
P21W
Лампа габаритного огня

P10W
Лампа света заднего хода

W16W
Лампа указателя поворота
А12-21-4
PY21W

Лампа передней противотуманной фары

h21
Лампа бокового указателя поворота
А12-5-2
W5W
Лампа освещения номерного знака (для кузова «седан»)
АC12-5-1
C5W
Лампа освещения номерного знака (для кузова «хэтчбек»)
А12-5-2
W5W
Лампа общего освещения салона автомобиля
АC12-10-1
C10W
Лампа индивидуального освещения мест водителя и переднего пассажира
АC12-4-1
T4W
Лампа освещения багажника
АC12-5-1
C5W

Лампы ДХО Лада Гранта: замена, какие лучше

Лампа ходовых огней появилась в арсенале современных автомобилей сравнительно недавно. В техническом руководстве отечественной модели Лада Гранта четко обозначено, что роль дневных ходовых огней (ДХО) возложена на габаритную оптику, конструкция которой является двух-нитевой. Во время включения зажигания сначала загорается нить, отвечающая за работу ДХО, а с активацией фар происходит одновременное включение габаритного освещения. Мощность первой из обозначенных нитей составляет 21 Вт, а второй – 5 Вт.

Для ходового освещения производитель применяет обыкновенные лампы ДХО. Самым неоспоримым преимуществом таких приборов является их низкая стоимость, а вот «минусов» более, чем достаточно. Об этом свидетельствуют рекламации покупателей, где отражено недовольство тусклым световым пучком желтоватого оттенка и низким показателем ресурса осветительного устройства. Многих владельцев машины интересует вопрос: как поменять лампочку ходовых огней.

Такая расстановка фактов заставляет владельцев Лада Гранта «бросаться» на поиски аналогов ДХО и заменять при первой возникшей возможности. В роли таковых приборов подойдут светодиодные лампы ДХО без цоколей или обычные устройства, но с повышенной светоотдачей и более приятным цветовым спектром излучения. В ассортименте любого специализированного магазина таких ламп предостаточно. Если владельцу по душе светодиодная техника, то специалисты советуют брать к учету параметр их яркости. Что делать, когда необходима замена лампы ходовых огней.

О лампах с повышенным визуальным комфортом

Для Лада Гранта такая лампа ходовых огней являюется обычными осветительными приборами, выполненными по стандартной галогенной технологии, но имеющие более приятный белый световой спектр. В виде главного их недостатка фигурирует снижение видимости при дождливой погоде. Это объясняется склонностью белого света давать больше бликов от намокших поверхностей и дождевых капель в сравнении с желтым оттенком.

Если конкретизировать данный момент, то в числе наиболее распространенных галогенных продуктов, которые охотно приобретаются многими владельцами, можно увидеть следующие:

  • «OSRAM» и «General Electric»;
  • «Маяк» и «Philips»;
  • «Narva», «IPF» и «Hella».

Это еще не весь рекомендованный перечень приборов. Если поинтересоваться приоритетами производителя авто, то ему симпатизируют «OSRAM h5». Эти устройства имеют два варианта исполнения:

  • «Standard»;
  • «Light Day».

Первая версия обладает полным соответствием регламентам законодательного характера в плане обеспечения безопасных условий применения, в числе которых: сила тока, светотеневая граница, освещенность, геометрия подачи пучка и мощность.

Второй вариант имеет выгодное отличие от первого в плане повышенного ресурса, однако уступает в мощности светового пучка. Однако, приобрести приборы это одно, необходимо знать, как поменять лампочку ходовых огней своими руками.

Если требуется замена ламп, то ее осуществляют следующим простым методом.

Отвечаем на вопрос, как поменять лампочку ходовых огней своими силами.

  1. Обеспечиваем комфортный доступ к осветительному устройству левой (по ходу) стороны. С этой целью извлекаем корпус фильтрующего компонента воздушного впускного тракта с отсоединением датчика, его подводящих кабелей и патрубков.
  2. Сам корпус подвергаем принудительному смещению вверх и налево.
  3. Для обеспечения доступа к фаре правого бока авто требуется снятие декоративной крышки мотора. Здесь временно откручиваем масло-заливную пробку, затем отвинчиваем 4 крепежных узла и тянем крышку (отщелкиваем).
  4. Извлечение отработавшей лампы ДХО предполагает предварительный поворот патрона против часовой стрелки, после чего его извлекаем из посадочного гнезда. Вынув старую лампу, монтируем новый элемент в патронный паз. Теперь закручиваем сам патрон в блок.

Внимание! Смена галогенных устройств не «терпит» касания пальцами к поверхности их колб.

Это связано с риском оставления отпечатков от потожировых выделений, что негативно сказывается на ресурсе прибора. Рекомендуем в работе пользоваться хлопчатобумажными перчатками, не имеющими резинового напыления на рабочих зонах. Перед монтажом ламп на LADA Granta их колбы протирайте спиртосодержащими салфетками. Именно так и происходит замена лампы ходовых огней.

Коврик в багажник Лада Гранта лифтбек

Сравнение Веста и Гранта сравнение

Диодные ходовые огни

Обозначенный процесс замены ламп на Лада Гранта не предполагает обладания владельцем сверх — способностей, однако сопряжен с некоторыми незначительными нюансами.

  1. Замена лампы ходовых огней на светодиодные аналоги предполагает свое выполнение одновременно в обеих фарах.
  2. При монтаже светодиодных устройств требуется обязательное соблюдение полярности их подключения.

Внимание! Если не учесть необходимость обеспечения полярности, то это приводит к мгновенному выходу из строя самого осветительного устройства. Кроме того, в зону риска попадает предохранитель, защищающий цепь ДХО.

К проверке полярности огней на LADA Granta следует привлекать тестер с включенным в нем режимом вольтметра. Перед извлечением отработанных ламп включаем ДХО. Когда контакты приемников получают напряжение, к их поверхности подносим щупы вольтметра (красный с черным). Смотрим на показания и, если обнаруживаем отрицательное значение, то это свидетельствует о нарушении порядка (полярности) подключения. Цифровой тестер в таком случае выводит на экран «минус», а аналоговый – «загоняет» стрелку ниже «нуля».

Особенности монтажа светодиодных ДХО

Если не удалось отыскать устройства для Лада Гранта без цоколей, то можно остановиться на применении обычных изделий. Здесь понадобится собственноручное удаление цоколя, а его освободившиеся контакты требуется подгонять под монтажные отверстия.

После завершения процедуры замененные приборы не следует выбрасывать. Это объясняется потребностью соблюдения регламента, регулирующего нормативно-технические требования к аспектам дневного освещения, что предполагает посещение тех-центра. Если этим пренебречь, то возможен риск запрещения эксплуатации автомобиля с доработанной таким образом светотехникой при очередном техосмотре.

Сегодня рыночная сеть способна предложить массу светодиодных устройств для LADA Granta, обладающих разным спектром освещения. Однако регламентные нормы говорят о допустимости только белого или желтого оттенка для ДХО, а остальные альтернативы запрещены.

Приборы на светодиодной технологии, в том числе и лампы ДХО отличаются от галогенных сравнительно меньшим потреблением энергии. Это позволит в дальнейшем снизить уровень нагрузки на АКБ. Забыв однажды деактивировать ДХО на ночь, вы все равно минимизируете риск разрядки аккумулятора.

Конструктивное устройство системы освещения Лада Гранта предполагает присутствие в схеме реле, несущего ответственность за обеспечение функционала ДХО. Кроме этого, данное устройство обеспечивает подачу питания к стоп-сигналам и инжектору. Ввиду сниженного энергопотребления светодиодных устройств на авто LADA Granta, реле способно генерировать некорректные показания, сетуя на неисправность ДХО. При такой картине лампа ходовых огней на «приборке» будет активироваться с надоедливой частотой, а встроенный диагностический комплекс издавать звуковые сигналы. Чтобы ликвидировать проблему, потребуется замена стандартной панели на экспортный аналог, устанавливаемый в европейские версии Лада Гранта. А как поменять лампочку ходовых огней мы описали выше.

Петлевая изотермическая амплификация (LAMP) — обзор и классификация методов последовательноспецифического обнаружения

В течение последних 20 лет изотермические тесты амплификации нуклеиновых кислот превратились в важный диагностический инструмент не только для клинических применений, но также для контроля качества пищевых продуктов и мониторинга окружающей среды. Петлевая изотермическая амплификация (LAMP) хорошо известна своей надежной, высокочувствительной и специфической амплификацией целевой ДНК, которая достигается за счет использования до шести праймеров.Кроме того, LAMP выделяется своими изотермическими и энергоэффективными требованиями к усилению, что делает его главным кандидатом для недорогой диагностики и анализа в случае необходимости. В последнее время методы обнаружения, специфичные для последовательности, приобрели большее значение, поскольку, в отличие от методов обнаружения, не зависящих от последовательности, они обладают высокой специфичностью по отношению к целевой ДНК. За последние 13 лет появилось множество методов, зависящих от последовательности, основанных на очень разнообразных методах зондирования, включая оптическое, магнитное, пьезоэлектрическое, электрохимическое и магниторезистивное зондирование.Чтобы дать структуру разнообразному множеству методов, специфичных для последовательности, мы создали систематическую классификацию и предоставили критическую сравнительную оценку в соответствии с каталогом критериев (аналитические характеристики, мультиплексирование, количественная оценка и инструментальные требования). Обнаружение на основе флуоресценции, составляющее половину методов, может обрабатываться на открытых платформах и удовлетворяет всем критериям, перечисленным ранее. Аппаратные требования обсуждаются с точки зрения сложности, портативности и жидкостных картриджей.Кроме того, оценивается уровень технологической готовности и тип платформы (открытая по сравнению с , адаптированная к конкретным методам), причем последняя играет важную роль в миниатюризации и автоматизации этапов операционного процесса. Мы также наблюдаем рост использования встроенных в смартфоны датчиков для улучшения тестирования точек необходимости на основе LAMP. Таким образом, последние разработки в методах последовательного обнаружения LAMP демонстрируют высокий потенциал для многих будущих приложений.

Новый ратиометрический зонд на основе FRET для флуоресцентного и колориметрического анализа аденозин-5′-трифосфата

В этой статье сообщается о новом ратиометрическом зонде для обнаружения аденозин-5′-трифосфата (АТФ), который основан на индуцированной связыванием модуляции резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) в сочетании с механизмом восприятия тушения, вызванного агрегацией (ACQ).Введение флуорофоров кумарина в качестве доноров FRET в боковую цепь политиофена (PT) в качестве акцептора FRET обеспечивает ратиометрический зонд. При добавлении АТФ образование комплекса полимер / АТФ приводит к конформационным изменениям основной цепи РТ от случайного клубка к плоской конформации и агрегации. Таким образом, ратиометрическое обнаружение АТФ может быть достигнуто за счет использования преимуществ изменения спектрального перекрытия для модуляции эффективности FRET от флуорофоров кумарина до основной цепи РТ до и после добавления АТФ в сочетании с ACQ.Зонд показал четкое изменение сигнала двойной эмиссии типа качелей при связывании с сильным сродством ( K приложение = 3,12 × 10 4 M -1 ) с АТФ в водном растворе, тогда как для ADP, AMP или различных других анионов явных изменений эмиссии не наблюдалось. Зонд также можно использовать для обнаружения АТФ невооруженным глазом и мониторинга реакции гидролиза АТФ апиразой в режиме реального времени в условиях физиологического pH.

У вас есть доступ к этой статье

Подождите, пока мы загрузим ваш контент… Что-то пошло не так. Попробуй еще раз?

Государственная субсидия на хороший ремонт — 5337

Государственная программа субсидий на хороший ремонт (49 U.S.C. 5337) предоставляет капитальную помощь для проектов по техническому обслуживанию, замене и реабилитации высокоинтенсивных фиксированных путепроводов и автобусных систем, чтобы помочь транспортным агентствам поддерживать активы в хорошем состоянии. Кроме того, гранты SGR имеют право на разработку и реализацию планов управления транзитными активами.

Соответствующие получатели

Правомочные получатели — это органы государственной власти и местного самоуправления в УЗА с фиксированными направляющими и системами высокоскоростного автобуса, обслуживающими доходы не менее семи лет.

Допустимые виды деятельности

State of Good Repair Grants Средства доступны для капитальных проектов, которые содержат фиксированные направляющие или систему автобуса высокой интенсивности в состоянии хорошего ремонта, включая проекты по замене и восстановлению:

  • подвижной состав
  • трек
  • линейное оборудование и конструкции
  • сигналы и связь
  • энергетическое оборудование и подстанции
  • пассажирских вокзалов и терминалов
  • охранное оборудование и системы
  • техобслуживания и оборудование
  • оперативно-вспомогательного оборудования, включая компьютерное оборудование и программное обеспечение;

, а также реализовать планы управления транспортными активами.

Нормативные ссылки

49 U.S.C. Раздел 5337 / Закон о FAST Раздел 3015

Доступность средств

Фонды доступны для исполнения обязательств на четыре финансовых года. Сюда входит финансовый год, в котором сумма выделяется или выделяется, плюс три дополнительных года.

Распределение финансирования

Распределение средств осуществляется по установленной законом формуле. Средства, выделяемые UZA на высокоинтенсивные системы фиксированных направляющих, основаны на доходных милях и милях маршрута, сообщаемых в Национальную базу данных транзитных перевозок (NTD), и на том, что UZA получило бы в формуле модернизации фиксированных направляющих путей на 2011 финансовый год с использованием текущего определения фиксированных направляющих. .Фонды для высокоинтенсивных автобусов выделяются UZA на основе миль доходов и миль маршрута, сообщаемых NTD.

Матч

Федеральная доля приемлемых капитальных затрат составляет 80 процентов от чистой стоимости капитального проекта, если получатель гранта не запрашивает более низкий процент.

Разрешение на грант: 49 U.S.C. 5337

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Анализ

LAMP для обнаружения РНК SARS-CoV-2 с использованием колориметрического считывания на основе поглощения

Материалы и методы

Методика эксперимента
FLUOstar Omega предварительно нагревали до 65 ° C в течение 2.За 5 ч до инкубации LAMP-анализа. Поз. контроль, включенный в набор для анализа LAMP (n-ген), разводили 1:10 в воде, свободной от нуклеаз, до концентрации 100000 копий / мкл. Колориметрические реакции LAMP проводили в конечном реакционном объеме 5 мкл (см. 4). Концентрации компонентов набора для анализа LAMP использовали в соответствии с инструкциями производителя. Основная смесь, праймеры, гидрохлорид гуанидина, вода, не содержащая нуклеаз, и матрица были предварительно смешаны, перенесены в черный 384-луночный планшет и центрифугированы в течение 1 мин при 400 g.Образцы для анализа LAMP измеряли в четырех повторностях. Образцы распределяли по пластине. Планшеты герметизировали с помощью герметика для количественной ПЦР, а затем считывали на FLUOstar Omega, используя следующие настройки, время цикла считывания планшета основано на полном 384-луночном планшете:

Настройки прибора

306 9013 для встряхивания с до цикла 1, 6 и 11
Параметры оптики Поглощение, кинетический режим пластины
Спектрометр 415 нм
560 нм
Общие настройки (самые быстрые)

9014 9013 Время установки
0.0 с
Кинетические настройки Количество циклов 27
Время цикла 133 с
Инкубация 65 ° C

Анализ данных
Разницу между оптической плотностью при 415 нм и 560 нм (∆OD) использовали для анализа чувствительного к pH изменения цвета в течение времени инкубации 2 .Время до максимума крутизны для отдельных кривых сигнала было рассчитано, чтобы различать положительные сигналы. и отрицательные (отрицательные) контроли в программе FLUOstar Omega MARS.

Результаты и обсуждение

Для оценки амплификации нуклеиновых кислот ∆OD поз. и нег. Контроль за контрольной группой проводился в течение 60 минут (рис. 2). Существенное увеличение ∆OD наблюдалось для поз. контроли примерно через 18 мин после начала анализа LAMP. Это увеличение ∆OD в поз.контроль происходил сравнительно в отдельных лунках-репликаторах и тестовых прогонах. Нег. элементы управления также показали увеличение ∆OD, однако это изменение произошло позже и показало более низкий наклон и более высокую вариацию по скважинам.

Целостность липидных наноносителей в кровотоке и опухоли количественно оценена с помощью ратиометрической FRET-визуализации в ближнем инфракрасном диапазоне у живых мышей

Реферат

Липидные наноносители считаются многообещающими кандидатами для доставки лекарств и борьбы с раком из-за их низкой токсичности, биоразлагаемости и способности инкапсулировать лекарства и / или контрастирующие агенты.Однако их биомедицинское применение в настоящее время ограничено из-за плохого понимания их целостности in vivo . Чтобы решить эту проблему, мы сообщаем о флуоресцентных каплях наноэмульсии размером 100 нм, инкапсулирующих липофильные цианиновые красители 5,5 и 7,5 ближнего инфракрасного диапазона с помощью объемного гидрофобного противоиона тетрафенилбората. Превосходная яркость и эффективная передача энергии резонанса Фёрстера (FRET) внутри липидных НК позволили впервые получить количественную флуоресцентную ратиометрическую визуализацию целостности НК непосредственно в кровообращении, печени и ксенотрансплантатах опухоли живых мышей с использованием установки визуализации всего животного.Эта уникальная методология показала, что целостность наших FRET NC в кровообращении здоровых мышей сохраняется на уровне 93% через 6 часов после введения, в то время как в печени она снижается до 66% (период полувыведения составляет 8,2 часа). Более того, эти NC демонстрируют быстрое и эффективное накопление в опухолях, куда они входят в почти неповрежденной форме (77% целостности через 2 часа), прежде чем теряют свою целостность до 40% через 6 часов (период полураспада составляет 4,4 часа). Таким образом, мы предлагаем простую и надежную методологию, основанную на ратиометрической визуализации FRET in vivo для количественной оценки целостности наноносителей у мелких животных.Мы также демонстрируем, что капли наноэмульсии представляют собой удивительно стабильные нанообъекты, которые остаются почти неповрежденными в кровотоке и высвобождают свое содержимое в основном после попадания в опухоли.

Ключевые слова

Липидные наноносители

In vivo визуализация

Ближний инфракрасный диапазон FRET

Целостность наноносителей

Повышенная проницаемость и удерживание

Опухоль

Рекомендуемые статьи Цитирующие статьи (0) 2016

Авторы.Опубликовано Elsevier BV

Рекомендуемые статьи

Цитирующие статьи

Слитые белки GPCR-G, связанные с ER / K, систематически модулируют ответ вторичного мессенджера в клетках

Реагенты и буферы

Фибронектин, натриевая соль гуанозин-5′-дифосфата (GDP), 3-изобутил-1-метилксантин (IBMX), (-) — изопротеренол (+) — битартратная соль, форсколин и тартрат метопролола были приобретены у Sigma-Aldrich. Гемисульфат сальбутамола был приобретен у Tocris. n -додецил-β-D-мальтопиранозид, Anagrade (DDM) был куплен у Anatrace.Антитело против Gβ (SC378) и антитело против НА (MMS-101p) были приобретены у Santa Cruz Biotechnology и Covance соответственно. кДНК для изоформы 3 α1 A -AR ( Homo sapiens ) и α2 A -AR ( Sus scrofa ) были любезными подарками от доктора Ричарда Нойбига. кДНК для человеческого β2-AR, длинного варианта сплайсинга Gαs, Gαi 2 изоформы 1 и Gαq были приобретены у GE (Open Biosystems). Человек A 1 R был приобретен из репозитория плазмид DNASU. Реагенты для трансфекции ДНК X-tremeGENE HP и ДНК Mirus-LT были приобретены у компаний Roche и Mirus соответственно.Буфер A представляет собой 20 мМ HEPES, 5 мМ KCl, 145 мМ NaCl, 2 мМ CaCl 2 , 1 мМ MgCl 2 , 0,2% декстрозы (мас. / Об.), 1,5 мкг мл -1 апротинина и 1,5 мкг мл. -1 лейпептин при pH 7,45. Буфер B представляет собой 20 мМ HEPES, 0,5 мМ EDTA, 5 мМ MgCl 2 , 0,1 мМ DTT, 10 мкМ GDP, 1,5 мкг мл -1 апротинина, 1,5 мкг мл -1 лейпептина и 50 мкг мл -1. фенилметансульфонилфторид (PMSF) при pH 7,4. Буфер C представляет собой 20 мМ HEPES, 0,5% монододециловый эфир декаэтиленгликоля (C 12 E 10 ), 100 мМ NaCl, 1 мМ MgCl 2 10 мкМ GDP, 5.5 мМ β-меркаптоэтанол, 10 мкг мл -1 PMSF при pH 8,0. Буфер D представляет собой забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS pH 7,4; Gibco TM ), 800 мкМ аскорбиновой кислоты и 0,2% декстрозы (мас. / Об.).

Молекулярное клонирование

ПЦР-продукты для α1 A -AR (изоформа 3), β2-AR, A 1 R, длинный вариант сплайсинга Gαs, Gαi 2 и Gαq были получены из кДНК человека. Для экспрессии HEK293 у млекопитающих все конструкции GPCR и Gα клонировали в вектор PCDNA5 / FRT. Для клонирования датчиков GPCR была разработана модульная схема.Каждый сенсор белка GPCR-G содержал от N- до С-конца: полноразмерный GPCR, mCitrine (акцептор FRET), линкер ER / K 10, 20 или 30 нм, mCerulean (донор FRET) и субъединицу Gα. Линкер (Gly-Ser-Gly) 4 вставляли между всеми доменами белка как часть последовательности праймера, чтобы обеспечить свободное вращение между доменами. Контрольные датчики GPCR (-) не содержали субъединицу Gα после mCerulean, а вместо этого имели повторяющиеся (Gly-Ser-Gly) 4 остатков. Все β2-AR-сенсоры также содержали либо N-концевую HA-метку, либо His-метку.Все конструкции были подтверждены секвенированием. Пептидные последовательности для линкеров ER / K 10, 20 и 30 нМ были описаны ранее 14 . Вкратце, линкер ER / K 10 нм происходит из белка Myosin VI Sus scrofa со следующей аминокислотной последовательностью: EEEEKKKQQEEEAERLRRIQEEMEKERKRREEDEQRRRKEEEERRMKLEMEAKRKQEEEERKKREDDEKRKKK. 30 нм линкер является производным от Kelch-мотив белка семейства ( трихомонад ): EEEEKKKEEEEKKQKEEQERLAKEEAERKQKEEQERLAKEEAERKQKEEEERKQKEEEERKQKEEEERKLKEEQERKAAEEKKAKEEAERKAKEEQERKAEEERKKKEEEERLERERKEREEQEKKAKEEAERIAKLEAEKKAEEERKAKEEEERKAKEEEERKKKEEQERLAKEKEEAERKAAEEKKAKEEQERKEKEEAERK.Линкер ER / K 20 нм содержит первые 130 остатков линкера ER / K 30 нм, использованного в этом исследовании.

Подготовка клеток млекопитающих и экспрессия сенсора

Клетки HEK293T-Flp-In (HEK293T, Invitrogen) культивировали в среде DMEM с добавлением 10% FBS (об. / Об.), 4,5 г л. -1 D-глюкозы, 1% глутамакса. , 20 мМ HEPES, pH 7,5 при 37 ° C в увлажненной атмосфере при 5% CO 2 . Клетки HEK293T помещали в 6-луночные планшеты, обработанные культурой ткани, при ~ 30% конфлюэнтности. Через 16–20 ч клетки трансфицировали реагентом для трансфекции ДНК X-tremeGENE HP.Условия трансфекции, включая количество ДНК (1,4–4 мкг ДНК + 4,2–6 мкл реагента) и продолжительность трансфекции (контрольные датчики: 18–24 ч; Gα-датчики: 22–32 часа), были оптимизированы для постоянного получения эквивалентных уровней выражение сенсора в разных условиях. Для анализа конкуренции белка GPCR-G 100 нг, 300 нг или 1 мкг темного Gαx были котрансфицированы 2 или 4 мкг указанных сенсоров. Для всех экспериментов целостность сенсора, локализация и экспрессия сенсора на оптическую плотность (О.) отслеживались для обеспечения согласованности. Эксперименты проводились при эффективности трансфекции 60–80%, оцениваемой при 20- и 40-кратном увеличении на микроскопе для культивирования тканей Nikon с функцией детектирования флуоресценции. Кроме того, во время эксперимента 60–90% трансфицированных клеток экспрессировали преимущественно сенсор, локализованный на плазматической мембране, с минимальной локализацией во внутриклеточных компартментах. Каждый эксперимент проводился при эквивалентном выражении сенсора и соответствующем O.D. суспензии клеток, используя следующие шаги.Сначала клетки ресуспендировали осторожным пипетированием в исходную среду. Затем клетки центрифугировали (300 г, 3 мин) и один раз промывали буфером А. Затем клетки ресуспендировали в соответствующем объеме буфера А до достижения ОП 0,3. ( 600 нм , спектрофотометр BioMate 3 S, Thermo Scientific, длина пути 3 мм, оптическая стеклянная кювета) для всех измерений на основе флуоресценции. Наконец, экспрессию сенсора измеряли по флуоресценции mCitrine. Флуоресценция мЦитрина держалась в пределах 1.6–2,4 × 10 6 отсчетов в секунду (c.p.s) для внешнего диаметра ячейки. 0,3. Для каждого эксперимента целостность сенсора отслеживалась путем измерения отношения mCitrine (возбуждение 490, полоса пропускания 8 нм; диапазон излучения 500–600, полоса пропускания 4 нм; максимум эмиссии 525 нм) к соотношению флуоресценции mCerulean (возбуждение 430, полоса пропускания 8 нм; диапазон излучения 450-600 полоса пропускания). 4 нм; максимум излучения 475 нм). В рамках конструкции сенсора mCitrine и mCerulean маркируют C-конец GPCR и N-конец субъединицы Gα соответственно. Все эксперименты проводились при соотношении флуоресценции mCitrine и mCerulean, равном 1.7–2.1.

Микроскопия живых клеток и анализ изображений

Клетки HEK293T высевали (~ 15–20% конфлюэнтности) на чашки со стеклянным дном 35 мм (MatTek Corp), покрытые 10 мкг мл фибронектина -1 . Через 14–16 часов после посева (30–40% конфлюэнтности) клетки трансфицировали реагентом для трансфекции ДНК Mirus-LT или XtremeGENE HP. Через 16–22 ч после трансфекции клетки промывали трижды буфером A (37 ° C) для удаления избытка фенолового красного из среды. Затем клетки визуализировали в течение не более 30 мин в среде с буфером А.Изображения клеток получали при 60-кратном увеличении с использованием микроскопа Nikon TiE, оснащенного ртутной дуговой лампой, масляными объективами Plan-Apo с числовой апертурой 60x и 100×1,4 и камерой Evolve 512×512 EM-Charge-Coupled-Device (Photometrics). Изображения Z-стека были получены с шагом 1 мкм, и полученный стек изображений был деконволюционирован с помощью программного обеспечения AutoQuantX. Экспрессия мембраны на изображениях была проанализирована в ImageJ (NIH) с использованием инструментов порога и измерения для выбора и количественной оценки экспрессии мембраны по сравнению с внутренней локализацией.(Дополнительный рис. 1).

Измерения флуоресценции

Используя флуорометр FluoroMax-4 (Horiba Scientific), спектры FRET были получены путем возбуждения клеток при 430 нм (полоса пропускания 8 нм) в оптической стеклянной кювете (3–3.30-SOG-3, Starna Cells Inc.) . Эмиссия сканировалась в диапазоне 450–600 нм (полоса пропускания 4 нм). Для измерений только mCitrine клетки выходили на длине волны 490 нм (полоса пропускания 8 нм), а эмиссия регистрировалась в диапазоне 500-600 нм (полоса пропускания 4 нм), максимум эмиссии был установлен на 525 нм.

Расчет FRET живых клеток

Измерения FRET проводились на совпадающих O.D. в буфере A. Нетрансфицированные и трансфицированные клетки ресуспендировали в буфере A при 0,3 O.D. Чтобы скорректировать рассеяние, спектр излучения FRET нетрансфицированной клеточной суспензии при эквивалентном O.D. вычитали из FRET-спектра трансфицированной клеточной суспензии. Скорректированные эмиссионные спектры FRET были нормированы на эмиссию mCerulean (475 нм). Затем рассчитывали соотношение FRET путем деления эмиссии mCitrine (525 нм) на эмиссию mCerulean (475 нм).

ΔFRET эксперименты

Живые клетки ΔFRET эксперименты проводили, как описано ранее 21 .Вкратце, клетки получали и повторно суспендировали в предварительно нагретом буфере А. Аликвоты клеток по 90 мкл добавляли в пробирки Эппендорфа, помещенные на водяную баню при 37 ° C. Образцы обрабатывали 10 мкл указанного лиганда или контрольного буфера в течение 1, 5 или 10 мин при 37 ° C. Отдельные и чистые кюветы использовались для сбора спектров FRET для обработанных и необработанных образцов для предотвращения перекрестного загрязнения. Изменение FRET (ΔFRET) рассчитывали как FRET лиганд — FRET буфер .

Обратимость агонист-индуцированного ΔFRET

Клетки получали, как описано в разделе подготовки клеток.Сначала измеряли соотношение FRET без обработки. Необработанные клетки центрифугировали (600 г, 1 мин), трижды промывали и ресуспендировали в 400 мкл буфера А. Спектры FRET собирали серийно для аликвот по 90 мкл. Затем отдельную лунку собирали в буфер A с добавлением 100 мкМ изопротеренола. Затем клетки центрифугировали (600 г, 1 мин) и трижды промывали 400 мкл буфера A с добавлением 100 мкМ изопротеренола. Этапы отжима и стирки были завершены в течение 5 минут. ΔFRET рассчитывали путем вычитания необработанных соотношений FRET из соотношений FRET, измеренных в условиях, обработанных изопротеренолом.Для оценки обратимости индуцированного изопротеренолом ответа ΔFRET клетки инкубировали в буфере A с добавлением 100 мкМ изопротеренола в течение 3 минут на водяной бане при 37 ° C. Клетки центрифугировали (600 г, 1 мин), промывали три раза и ресуспендировали в 400 мкл буфера A. Спектры FRET собирали серийно для аликвот по 90 мкл. ΔFRET рассчитывали путем вычитания необработанных соотношений FRET из соотношений FRET, измеренных в условиях вымывания изопротеренола. mCitrine: О.Д. соотношение поддерживалось постоянным во всех условиях, чтобы гарантировать, что каждое измерение FRET проводилось при постоянных уровнях экспрессии сенсора при фиксированной плотности клеток.

Подготовка мембраны

24 или 48 ч после трансфекции (XtremeGene HP) Клетки HEK293T, экспрессирующие указанные сенсоры, собирали и промывали один раз холодным буфером PBS, содержащим 1,5 мкг мл -1 апротинина и 1,5 мкг мл -1 лейпептина. При необходимости этапы выполняли на льду и / или при 4 ° C. Клетки инкубировали в буфере для гипотонического лизиса (20 мМ HEPES, 0,5 мМ EDTA, 0,1 мМ DTT, 1,5 мкг мл -1 апротинина, 1,5 мкг мл -1 лейпептина и 50 мкг мл -1 фенилметансульфонилфторида, pH 7 .4) на 5 мин. Клетки лизировали шприцем на 1 мл в предварительно охлажденном клеточном гомогенизаторе (Isobiotec) с зазором 8 микрон. Лизированные клетки центрифугировали при 500 g в течение 5 мин при 4 ° C. Супернатанты, содержащие клеточные мембраны, центрифугировали при 45000 об / мин в течение 45 мин при 4 ° C. Осадки мембран промывали 3 раза предварительно охлажденным буфером для суспензии, содержащим 20 мМ HEPES, 0,5 мМ EDTA, 5 мМ MgCl 2 , 0,1 мМ DTT, 3 мкМ GDP, 1,5 мкг мл -1 апротинин, 1,5 мкг мл -1. лейпептин и 50 мкг мл -1 фенилметансульфонилфторид при pH 7.4. Для анализов связывания радиолиганда мембраны промывали 3 раза холодным буфером для ресуспендирования с добавлением 100 мМ NaCl. Мембраны ресуспендировали в 1 мл указанного предварительно охлажденного буфера, используя вращающийся пестик (Fisherbrand, 30 с). Мембраны снова вращали при 45000 об / мин в течение 45 минут при 4 ° C. Осадки мембран ресуспендировали в соответствующих буферах для ресуспендирования с использованием гомогенизатора Даунса. Концентрацию общего белка (мг / мл -1 ) рассчитывали с использованием анализа белка DC (Bio-Rad). Мембраны мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° C.

Очистка сенсора из клеток HEK293

Для экспериментов против Gβ очистка белка His tag-β2-AR-G и контрольных (-) сенсоров из клеток HEK293T следовала ранее опубликованному протоколу 16 . Замороженные мембраны быстро оттаивали до комнатной температуры и кратковременно повторно гомогенизировали вращающимся пестиком. 5% холатный буфер (5% холат натрия в 50 мМ HEPES, 3 мМ MgCl 2 , 50 мМ NaCl с 1 мкг мл апротинина -1 , 1 мкг мл -1 лейпептин, 10 мкг мл -1 фенилметансульфонилфторид и 5.Добавляли 5 мМ β-меркаптоэтанол, pH 8,0) до конечной концентрации 1% холата. Эту смесь инкубировали на льду в течение 45 минут и разделяли ультрацентрифугированием при ~ 105000 g в течение 40 минут при 4 ° C. Супернатант собирали и разбавляли по каплям четырьмя объемами буфера С до одного объема супернатанта и осторожно пипетировали для перемешивания. Разбавленный супернатант добавляли к смоле никель-NTA (Qiagen) и инкубировали 30 мин при 4 ° C с вращением. Смолу промывали 3 раза 500 мкл буфера C + 5 мМ имидазола.Последнюю промывку удаляли, смолу доводили до комнатной температуры и элюировали в течение 3-5 минут 150 мкл элюирующего буфера (буфер C + 200 мМ имидазол). Элюированную смолу центрифугировали, супернатант собирали и измеряли флуоресценцию mCerulean и mCitrine на флуорометре (как описано выше). Образцы хранили в буфере для образцов SDS laemmli при -80 ° C.

Вестерн-блот

Для вестерн-блоттинга против НА 20 мкг мембран, содержащих сенсор β2-AR-Gs, кипятили в буфере B, дополненном буфером для денатурирования гликопротеина (NEB), при 95 ° C в течение 5 мин.Затем кипяченые образцы обрабатывали 500 единицами PNGase F (NEB) в течение трех часов при 37 ° C. Для анти-Gβ эквивалентное количество сенсоров, измеренное по флуоресценции mCitrine, загружали в гели SDS-PAGE (10% полиакриламид). Гели визуализировали для определения флуоресценции mCitrine (возбуждение 488 нм, эмиссия 520 нм, пропускная способность 40 нм) с использованием Typhoon Gel Imager (GE Healthcare). Гели переносили на мембраны из ПВДФ на три часа при 300 мА. Анти-HA и анти-Gβ блокировали 2% -ным молоком / трис-буферным физиологическим раствором с 1% твином (TBST) либо в течение одного часа при комнатной температуре, либо в течение ночи при 4 ° C.Затем блоты инкубировали с указанными первичными антителами в разведении 1: 1000 в 5% молоке / TBST. Для эксперимента против Gβ блоты промывали TBST и инкубировали с конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP) 1: 5 000 или 1: 10 000 вторичными антителами козьего антитела против кроличьего IgG (0031460, Fisher Scientific) в 5% молоке / TBST или 5 % BSA / TBST в течение одного часа при комнатной температуре. Аналогично для экспериментов против НА, блоты инкубировали с конъюгированным вторичным антителом овцы против мышиной HRP (GE Healthcare, NA931) в соотношении 1: 10 000.Все блоты проявляли с использованием вестерн-хемилюминесцентного HRP-субстрата Immobilon (Millipore). Блоты получали с использованием системы ChemiDoc-It Imaging (UVP). Изображения гелей и блотов были получены с использованием ImageJ (NIH).

Анализы радиоактивного лиганда

Анализы радиоактивного лиганда следовали ранее опубликованному протоколу 39 . Значения Bmax оценивали путем инкубации 2,5, 5 и 10 мкг мембраны с 5 нМ [ 3 H] -дигидроальпренолола ([ 3 H] -DHA; PerkinElmer) в течение 90 минут при комнатной температуре в трис-буферном растворе. Физиологический раствор (TBS) pH 7.4. Образцы переносили на мембраны GF / C, предварительно обработанные 0,3% раствором PEI в TBS, тщательно промывали холодным TBS и сушили в течение ночи при комнатной температуре. После добавления сцинтилляционной жидкости (Microscint0, PerkinElmer) радиоактивность измеряли с помощью 96-луночного сцинтилляционного счетчика (TopCount, PerkinElmer. Неспецифическое связывание оценивали с помощью обработки пропранололом 10 мкМ, и оно составило <1% от общего связывания. Константа диссоциации () K д ) связывания [ 3 H] -DHA определяли путем инкубации 7-10 пМ (7-10 фмоль / мл) рецептора с возрастающими концентрациями [ 3 H] -DHA. К Д связывания [ 3 H] -DHA составляло ~ 0,2 нМ для β2-AR-G и контрольных сенсоров. Конкурентное торможение ( K и ) оценивали путем инкубации 7 пМ рецептора с возрастающими концентрациями изопротеренола (ISO) или холостого буфера в присутствии 2 нМ [ 3 H] -DHA в течение 90 мин при комнатной температуре. Радиоактивность в образцах для К Д и K и экспериментов было измерено, как описано выше.Было обнаружено, что неспецифическое связывание во всех случаях составляет <1%. Каждый эксперимент проводился, по крайней мере, дважды с разными препаратами мембран, с тремя отдельными образцами, приготовленными для каждого условия, для каждого эксперимента.

Анализы цАМФ

28–32 ч после трансфекции (XtremeGENE HP) Клетки HEK293T, экспрессирующие указанный сенсор, собирали для оценки уровней цАМФ с использованием биолюминесцентного анализа цАМФ Glo (Promega). Клетки осторожно суспендировали в исходной среде, подсчитывали с помощью гемоцитометра и центрифугировали (300 г, 3 мин).Соответствующий объем буфера D добавляли для достижения плотности 2 × 10 6 клеток на мл -1 для базальных экспериментов или 4 × 10 6 клеток на мл −1 для анализов на основе лиганда. Суспензии клеток помещали в 96-луночные непрозрачные круглодонные планшеты. Чтобы оценить базальную продукцию цАМФ, клетки инкубировали в буфере D с добавлением 0,25 мМ IBMX в течение 15 мин при 37 ° C. Чтобы проверить вызванные изопротеренолом изменения уровней цАМФ, клетки инкубировали с различной концентрацией изопротеренола в течение 3 минут при комнатной температуре.Чтобы оценить Emax для продукции цАМФ, клетки инкубировали со 100 мкМ изопротеренола и 100 мкМ форсколина в течение 3 минут при комнатной температуре или 37 ° C. Для анализов подавления цАМФ клетки обрабатывали 1 мкМ форсколином и с лигандом или без него в течение 15 минут при 37 ° C. Впоследствии клетки лизировали и соблюдали протокол в соответствии с рекомендациями производителя (Promega). Люминесценцию измеряли с помощью микропланшетного люминометра-ридера (SpectraMax M5e, Molecular Devices). Уровни цАМФ (относительная люминесцентная единица, RLU) оценивали путем вычитания нетрансфицированного фона из трансфицированных условий.Каждый эксперимент имел четыре технических повтора для каждого условия и был независимо повторен не менее трех раз ( N > 3).

IP

1 анализы

28–32 ч после трансфекции (XtremeGENE HP) Клетки HEK293T, экспрессирующие указанный сенсор, собирали для оценки уровней IP 1 с использованием набора для анализа IP-One HTRF (Cisbio). Клетки осторожно суспендировали в исходной среде, подсчитывали с помощью гемоцитометра и центрифугировали (300 г, 3 мин). Соответствующий объем буфера StimB (CisBio: 10 мМ Hepes, 1 мМ CaCl 2 , 0.Добавляли 5 мМ MgCl 2 , 4,2 мМ KCl, 146 мМ NaCl, 5,5 мМ глюкозы, 50 мМ LiCl, pH 7,4) для достижения плотности 3 × 10 6 клеток / мл -1 . Клетки инкубировали при 37 ° C в течение 15 мин. Протокол производителя был изменен для достижения высокого отношения сигнал / шум. 150 мкл суспензии инкубировали в течение одного часа с 30 мкл буфера для лизиса (Cisbio), 54 мкл буфера StimB, 6 мкл IP 1 , конъюгированного с красителем d2, и 6 мкл меченного тербиевым криптатом моноклонального антитела анти-IP 1 .IP 1 FRET-спектры были получены путем возбуждения образцов при 340 нм (полоса пропускания 15 нм). Подсчет эмиссии регистрировали в диапазоне 600–700 нм (полоса пропускания 10 нм) с использованием длиннопроходного фильтра 475 нм (FSQ GG475, Newport). Исходный сигнал IP 1 был рассчитан из отношения 665 нм к 620 нм. Базальный сигнал IP 1 корректировали путем вычитания соотношения нетрансфицированных IP 1 из клеток, экспрессирующих трансфецированный сенсор. Для экспериментов с лигандами данные представлены как изменение исходного соотношения IP 1 после обработки лекарственным средством.Каждый эксперимент имел четыре повтора для каждого условия и был независимо повторен не менее трех раз ( N > 3).

Анализ кривых концентрация-ответ и радио-лигандные анализы

Данные анализировали в GraphPad Prism 7.0c (Graphpad Software, Inc.) для получения значений EC 50 для анализов накопления ΔFRET и цАМФ и IC 50 , К и , К Д Значения для анализов связывания радио-лиганда.Сигмоидальные кривые из экспериментов с ΔFRET и цАМФ анализировали с использованием аппроксимации кривой нелинейной регрессии с использованием логарифма (агонист или ингибитор) в зависимости от ответа (три параметра). Константа равновесной диссоциации для связывания изопротеренола с сенсорами β2-AR-Gs ( K и ) и IC 50 были рассчитаны путем подбора кривой связывания радиолиганда с использованием нелинейного регрессионного анализа с одним конкурентным сайтом — подгонка K и или один конкурентный сайт соответствуют параметрам logIC 5O соответственно.{n}} $

где E макс — это максимальный ответ цАМФ системы, оцениваемый обработкой клеток 100 мкМ форсколина и 100 мкМ изопротеренола, E представляет собой ответ цАМФ на изменяющуюся концентрацию изопротеренола ([ A ]) и n представляет собой наклон функции преобразователя, которая связывает занятость лиганда с ответом. К А Значение было ограничено соответствующим значением K и Значения получены из конкурентного анализа связывания радиолиганда (см. Выше).Значения 1 / τ были рассчитаны для оценки доли слияния β2-AR-Gs, связанного с изопротеренолом, которая генерирует половину максимального ответа цАМФ (см. Дополнительную таблицу 5).

Статистический анализ

Данные выражены в виде средних значений ± S.E.M. Эксперименты проводились независимо не менее трех раз с 3–6 техническими повторами на одно условие ( N > 3). Статистический анализ выполняли с использованием GraphPad Prism 7.0c (Graphpad Software, Inc.). Статистическую значимость для отдельных экспериментов проводили с использованием парного t-критерия Стьюдента.Чтобы оценить, как данные варьировались в экспериментальных повторах, данные были объединены и для оценки значимости были проведены парные или непарные t-критерии Стьюдента. Односторонний дисперсионный анализ ANOVA с пост-тестом Тьюки был выполнен для оценки значимости при оценке сравнений между несколькими условиями (рис. 3d, e, g) или между слияниями (рис. 5–6) со значениями p * p 0,05 ; ** p 0,01 ; *** p 0,001 ; **** p 0.

Оставить ответ