Моторное масло для лада х рей: Какое и сколько масла залить в Lada XRay ?

Качественное немецкое моторное масло для Lada XRay с допуском API SN в Челябинске

Где купить по настоящему качественное моторное масло для Вашей LADA XRay и не нарваться на подделку? Ответ — фирменный магазин немецких масел высочайшего качества — Liqui Moly 74. Купить моторное масло для Лада ИксРей (Автоваз Тольятти) допуск API SN. Такой вопрос задает себе автовладелец перед тем как настает момент замены масла. Купить масло Вы можете непосредственно в магазине по адресу Чайковского, д. 149 либо заказать его в интернет-магазине LM74 т.е. сделав заявку на нашем сайте. 

 Завод производитель автомобилей рекомендует применение масел с допуском API SN и вязкостью 5W-30, 5W-40. Учитывая очень сложные порой условия эксплуатации (пробки, большой разбег температур окружающей среды, низкокачественное топливо, пыль, эксплуатация на предельных нагрузках) двигателю автомобиля нужно действительно качественное и надежное моторное масло. Которое не только удовлетворяло бы допускам автопроизводителя (API SN), но и дополнительно защищало мотор на предельных нагрузках и сохраняло длительный срок свои свойства.

Наш интернет-магазин может предложить для владельцев LADA XRay с допусками API SN следующие синтетические моторные масла:

		Синтетическое маловязкое моторное масло Optimal HT Synth SAE 5W-30 в фасовке 1, 4, 20, 205 литров. Допуск: API CF/SN. Маловязкое масло для круглогодичного применения в автомобилях российского, европейского, корейского и японского производства. Произведено по новейшим технологическим требованиям, с отличными моющими свойствами благодаря высокому щелочному числу. Создает высокий уровень защиты и отличное смазывание деталей двигателя, экономит топливо и увеличивает срок службы двигателя. Наилучшим образом подходит для современных бензиновых и дизельных двигателей с многоклапанными механизмами и турбонаддувом, а также с эксплуатацией на газе (CNG/LPG). Температура застывания: — 36 град. С.
		Синтетическое фирменное моторное масло Molygen New Generation SAE 5W-30 (с молибденом и вольфрамом) в фасовке 1, 4, 5, 205 литров. Допуск: API CF/SN. Фирменный продукт Liqui Moly. Новинка продукции. Моторное масло созданное по технологии с фирменным антифрикционным пакетом присадок Molygen, на основе новейшей инновационной технологии «Molecular Friction Control». Высокопроизводительное моторное масло легкого хода для всесезонного применения. Нестандартные базовые масла, самые современные присадки и специальный компонент Molygen позволили получить низковязкое высокостабильное моторное масло, эффективно предотвращающее отложения, снижающее потери на трение и оптимально защищающее от износа. Температура застывания: -42 град. С.
		Синтетическое энергосберегающее моторное масло Special Tec AA SAE 5W-30 в фасовке 1, 4, 20, 205 литров. Допуск: ILSAC GF-5. Специальное масло для круглогодичного применения в автомобилях корейского, японского и американского производства. Всесезонное маловязкое моторное масло, произведенное по новейшим технологическим требованиям, с отменной защитой от износа, снижает расход топлива, обеспечивает чистоту двигателя и максимально быстрое поступление к трущимся деталям. Очень низкие потери масла на испарение. Температура застывания: -45 град. С.
		Синтетическое малозольное (Mid SAPS) моторное масло  Top Tec 4100 SAE 5W-40 в фасовке 1, 4, 5, 20, 205 литров. Допуск: API SN / CF. Специальное масло для всезонного применения в бензиновых и дизельных двигателей легковых автомобилей. Удовлетворяет современным требованиям международных стандартов API SN/CF и ACEA C3. Соответствует экологическим нормам EURO 4 и выше. Отлично подходит при использовании природного и сжиженного газа (CNG/LPG). Top Tec — группа масел со сниженным содержанием соединений серы (S), цинка (А) и фосфора (Р), а также со сниженной зольностью. Антиизносный пакет дополнен органическими соединениями молибдена. Температура застывания: -39 град. С.

Для постоянных клиентов действуют скидочная система, что позволяет приобретать товар высокого качества по более сниженной стоимости.

Также в нашем магазине в постоянном наличии имеются немецкие масляные фильтры для данного двигателя.

Фильтр масляный Mann Filter W 914/2 (производитель Германия). Размеры: A — 93 мм B — 62 мм C — 71 мм G — 3/4-16 UNF H — 69 мм

Моторное масло для двигателя 1.6, 1.8 Лада Икс Рей когда, сколько и какого заливать

Лада Икс Рей – компактный переднеприводный хэтчбек с высоким кузовом, стилизованным под кроссовер. Выпускается с 2015 года. Прообразом данной модели является одноименное трехдверное концепт-купе, представленное главным дизайнером АвтоВАЗа Стивом Маттином еще в 2012 году. Выставочная машина стоимостью 1 млн долларов была изготовлена под заказ в единственном экземпляре итальянской фирмой Vercarmodel Saro S. Впоследствии данный концепт стал новым дизайнерским направлением всех моделей АвтоВАЗа, включая Х Рей. Серийная версия данного автомобиля доступна в двух исполнениях: обычный хэтчбек и его кросс-версия с увеличенным клиренсом.

Содержание статьи

Период замены масла в двигателе Лада Х Рей

Масло в двигателе автомобиля Лада Икс Рей необходимо менять каждые 10 тыс. км или раньше. Все зависит от состояния смазочного материала, а также условий эксплуатации. Так, на моющие свойства масла могут негативно влиять агрессивная езда, несоблюдение ПДД, частые переключения передач, резкие старты и торможения в городских пробках, передвижение в слякотной и пыльной местности, буксировка тяжелых прицепов и т. д. В данной ситуации период замены масла лучше сократить до 6-7 тыс. км. В наиболее благоприятных условиях этот показатель равен 10 тыс. км, поскольку в данном случае период действия полезных присадок начинает истекать только после 8 тыс. км.

Сколько масла заливать в двигатель Лада Х Рей

Первое поколение, с 2015

Пятидверный хэтчбек Лада Икс Рей относится к В-классу, а по габаритам он чуть больше «Калины». Благодаря характерным пропорциям кузова машина выглядит как кроссовер, несмотря на отсутствие полного привода. Приподнятый кузов смотрится практично и стильно за счет Х-образного оформления передней части кузова, а также Х-образных выштамповок на боковых дверях, как у седана Веста. В основе хэтчбека лежит платформа от

Рено Сандеро второго поколения, однако с точки зрения дизайна экстерьера и интерьера это совершенно разные модели. У них идентичный каркас кузова и элементы подвески. Машина оснащается бензиновыми моторами 1.6 (98 и 106 л. с.), которые работают с МКПП-5. Также есть 1.8-литровый 122-сильный ДВС с роботизированной КПП. Кроме того, еще доступна версия с 1.6-литровым ниссановским мотором мощностью 114 л. с.

Бензиновые двигатели с 2015

• 1.6 106 л. с. (21129), объем масла – 4,4 литра (или 3,2 л – с АМТ), допуск и вязкость: API-SM, SN; SAE 5W-40, 0W-40, 0W-30, 10W-40, 10W-30
• 1.8 122 л. с. (21179), объем масла – 4,4 литра, допуск и вязкость: API-SM, SN; SAE 5W-40, 0W-40, 0W-30, 10W-40, 10W-30

Какое масло использовать для двигателя Лада Х Рей

Оригинальное

Производитель автомобиля Лада Икс-Рей рекомендует синтетическое моторное масло разной степени вязкости.

Вязкость подбирают исходя из температурных и климатических условий. Например, при эксплуатации круглый год подойдет вязкость 10W-40, 10W-30 или 5W-40. Летом можно остановить выбор на 20W-40 или 25W-50, а преимущественно в холодное время подойдет зимнее масло 0W-30, 0W-40 или 5W-30.

Неоригинальное

Владельцы автомобилей Лада Икс-Рей предпочитают недорогие моторные масла отечественных брендов Лукойл, Роснефть, G-Energy и Газпромнефть. Также можно предпочесть и более качественные смазочные материалы зарубежных брендов. При выборе совместимого масла необходимо учитывать допуск API, который подбирают в зависимости от года выпуска автомобиля, а также типа ДВС. Например, для бензинового Xray 2015 г. в. подойдет всесезонная синтетика с вязкостью 10W-40 и допуском API-SM. Для более свежих машин, выпущенных в 2020 году и позже, можно использовать тоже синтетику, но с допуском API-SN. Ниже представлены лучшие варианты моторных масел-аналогов для Лады Икс Рей:

• Шелл Хеликс Ультра 5W-40
• Лукойл Генезис 5W-40
• Ликви Моли 5W-40 Optimal Synth
• Мотуль 8100 5W-40
• Мобил Супер 3000 5W-40.

Проблемы при замене масла

Другие статьи:

Моторные и трансмиссионные масла для автомобилей Lada

ОАО «АВТОВАЗ» уже много лет лидирует по продажам легковых автомобилей на российском рынке. Основные причины популярности автомобилей Lada – умеренная цена, доступность обслуживания и приспособленность к российским условиям.

Lada выпускают на заводах в Тольятти и Ижевске. С 2010 года ВАЗ развивает партнерство с альянсом Renault-Nissan, с 2014 под контролем альянса находится более 50% акций компании. Сотрудничество открыло для российского производителя новые возможности – морально устаревшие «Жигули» и «Самару» заменили модели «Гранта» и «Ларгус», «Калина» была существенно модернизирована, в ближайшее время планируется запуск в производство моделей «Веста» и XRAY.

TOTAL QUARTZ 9000 5W-40

Универсальное моторное масло для Lada TOTAL QUARTZ 9000 5W-40 произведено по синтетической технологии и отвечает международным стандартам ACEA A3/B4 и API SN. Это масло образует очень прочную пленку на подверженных трению деталях двигателя, защищая их от износа, а моющие и диспергирующие присадки поддерживают их в чистоте, предотвращая образование вредных отложений. Исключительная стойкость данного масла к окислению гарантирует стабильность его свойств при длительном использовании, но, конечно, в рамках рекомендованных производителем автомобиля интервалов замены.

Важно, что моторное масло TOTAL QUARTZ 9000 5W40 подходит для любых условий эксплуатации и стиля вождения и может применяться в автомобилях ВАЗ любого возраста.

TOTAL QUARTZ 9000 5W40

TOTAL QUARTZ 9000 ENERGY 0W-30

При эксплуатации автомобиля в морозную погоду рекомендуется использовать моторные масла меньшей вязкости по SAE, которые сохраняют текучесть при более низкой температуре. Масло для Lada TOTAL QUARTZ 9000 ENERGY 0W-30 обеспечивает уверенный запуск двигателя при температуре -30 градусов и ниже, а так же за счет сниженного вязкого трения уменьшает расход топлива. Благодаря высоким защитным свойствам это масло предохраняет мотор от износа и отложений. Следует учесть, что при температуре окружающей среды выше +25 градусов АВТОВАЗ рекомендует применять масла с большей высокотемпературной вязкостью, то есть классов 5W-40 и 0W-40.

TOTAL QUARTZ 9000 ENERGY 0W30

Трансмиссионное масло для автомобилей Lada

Для автомобилей Lada с МКПП рекомендуются трансмиссионные масла TOTAL TRANSMISSION SYN FE 75W90 и TOTAL TRANSMISSION BV 75W-80. Данные масла защищают коробку передач от износа, продлевая срок ее службы, а так же предохраняют детали агрегата от коррозии.

TOTAL TRANSMISSION SYN FE 75W90

TOTAL TRANSMISSION BV 75W80

Узнайте подробнее о моторных и трансмиссионных маслах TOTAL.

Смотрите также:

Какое масло лучше заливать в двигатель Lada Xray

На этой странице нет воды. Чистая выжимка информации из всех ресурсов и немножко моего мнения. Я проанализировал данные сайтов и подобрал лучшие масла для двигателя Lada Xray. Если было полезно, оцените материал или оставьте свое мнение в комментариях, я рад ответить на любые вопросы!

FAQ, ликбез по подбору:

1. Какая вязкость подходит в двигатель Lada Xray?
   Подходит 0W-30, 0W-40, 5W-30, 5W-40, 10W-40. Зависит от окружающей среды и состояния двигателя.
2. Какой объем масла в двигателе Lada Xray?
   5 л будет достаточно. Посмотрите этот пункт в статье, объем зависит от модели двигателя.
3. Какой интервал замены масла в Lada Xray?
   Каждые 15 000 км или один раз в год, в зависимости от модели. Но я рекомендую менять чаще:)

Критерии подбора масла Lada Xray

Все масла подбираются исходя из соответствия SAE, ACEA, API. По составу оптимально использовать для Lada Xray полусинтетику или синтетику.

• ACEA A3/B4, A5/B5.
• API SL/SM/SN
• Вязкость подходит 0W-30, 0W-40, 5W-30, 5W-40, 10W-40., но чаще всего водители заливают 5W-40.

Информацию по вязкости для конкретного двигателя можно узнать из каталога взаимозаменяемости моторных масел: https://www.northsealubricants.com/en/oil-advisor

Каталогу можно доверять, данные взяты от производителей авто. При этом можно подобрать не только масло для двигателя, но и для коробки, гур, тормозной системы, системы охлаждения. Т.е все жидкости.

Оригинальные масла Lada

#1

LADA PROFESSIONAL 5W-40

Объем масла в двигателе Lada Xray

Двигатель			л.с.	Год выпуска (начало-конец)		Объем масла в двигателе (сервисный), л
1.6 16V	B	21129	106	2015	–>	4.40(4.10)
1.6 16V	B	HR16DE (h5M)	110	2015	–>	4. 70(4.20)
1.8 16V	B	21179	122	2016	–>	4.40(4.10)

Таблица подбора масла по сезону (зима, лето)

Год	Вязкость SAE всесезон от +25 до -25 °C зима от -35 до 0 °C лето от 0 до +35 °C	Бензин API	Дизель API	Тип	Рекомендуемые производители
2015	10W-40 10W-50 15W-40 5W-40 0W-40 5W-40 5W-50 20W-40 25W-40 25W-50	SM	CI-4	синтетика, полусинтетика	SHELL, Castrol, Mobil, Xado, ZIC, Лукойл, Valvoline, Gt-Oil
2016	10W-50 15W-40 5W-40 0W-40 5W-50 20W-40 25W-50	SN	CJ	синтетика	Mobil, Castrol, SHELL, Xado, Valvoline, Лукойл, ZIC, Gt-Oil
2017	10W-50 15W-40 15W-50 0W-40 0W-50 20W-40 25W-50	SN	CJ	синтетика	Castrol, SHELL, Mobil, Xado, ZIC
2018	10W-50 15W-40 15W-50 0W-40 0W-50 20W-40 25W-50	SN	CJ-4	только синтетика	SHELL, Mobil, Castrol, Xado
2019	5W-50 10W-50 0W-50 15W-50 20W-50	SN	CJ-4	только синтетика	SHELL, Castrol, Mobil
2020	5W-50 10W-60 0W-50 0W-60 15W-50 15W-60	SN	CJ-4	только синтетика	SHELL, Castrol, Mobil

Данные взяты с сайта autogener. ru. Они приближены к официальным, но такими не являются. По своему опыту скажу, что информацию применять можно, но с умом. Сильно доверять я бы ей не стал, но для ознакомления не помешает.

Лабораторные анализы

Допуски

• API SL/CF; ACEA A5/B5, A1/B1
• Renault RN 0700
• Ford WSS-M2C-913-D
• Ford WSS-M2C-913-A,B,C
• Jaguar Land Rover ST JLR.03.5003

Видеобзоры

Маслотест #46. Лукойл Генезис 5W-30 тест масла на трение

Масло Лукойл Genesis Armortech A5B5 5W-30 проверка CCS при.. -30гр.

Отзывы

Лабораторные анализы

Допуски

• ACEA A3/B3, A3/B4
• API SL/CF
• Meets Fiat 9.55535-D2
• MB-Approval 226.5/ 229.1
• Renault RN 0700 / RN 0710
• VW 502 00 / 505 00

Видеобзоры

Моторное масло Castrol Magnatec 10w-40 A3/B4

Castrol MAGNATEC 10W-40 R

Отзывы

Лабораторные анализы

Допуски

• API: CF/SL
• ACEA: A3/B4
• BMW: Longlife-01
• MB: 229. 5
• VW: 502 00/505 00
• Opel: GM-LL-A025/GM-LL-B025

Видеобзоры

Отзывы

Лабораторные анализы

Допуски

Стандарты:

Одобрения:

• MB-Approval 229.1;
• RENAULT RN0700;
• VW 501 01 / 505 00.

Соответствие требованиям:

Немного о масле

Отзывы потребителей указывают, что если соблюдать спецификации, то недостатков у смазки нет. Но многие отмечают немного завышенную цену у продукта.

Видеобзоры

Motul 4100 Turbolight 10w-40 — внешний вид упаковки

Motul 10w 40 turbolight 4100 Летнее моторное масло Рекомендую

Motul 4100 Turbolight 10W40 Jak skutecznie olej chroni silnik? 100°C

Отзывы

Лабораторные анализы

Показатель	Значение/Единица измерения
Кинематическая вязкость при 40°C	54,92
Кинематическая вязкость при 100°C	10. 01 сСт
Индекс вязкости	171
Сульфатная зольность	1.14%
Плотность при 15ºC	—
Температура вспышки (PMCC)	234ºC
Температура застывания	-44ºC
Допуск API	—
Допуск ACEA	A5/B5
Динамическая вязкость при -25℃	—
Динамическая вязкость, CCS при -30°С (5W)	—
Динамическая вязкость при -35℃	—
Щелочное число	9.98
Кислотное число	1.60
Содержание серы	0.226
ИК Спектр Фурье	—
NOACK	—

Допуски

• ACEA A5/B5
• Ford WSS-M2C913-C
• WSS-M2C913-D
• Cоответствует требованиям Jaguar Land Rover STJLR.03.5003

Отзывы

Подборка от Neste

City Standart 5W-30
City Pro LL 5W-30
City Pro A5/B5 0W-30

Подборка от Lukoil

LUXE SYNTHETIC SN/CF SAE 5W-40
LUXE SAE 15W-40
LUXE SYNTHETIC SL/CF SAE 5W-30
LUXE Semi-synthetic SAE 10W-30
LUXE Semi-synthetic SAE 5W-40
Genesis Armortech 5W-30 A5/B5
GENESIS ARMORTECH 5W-40
Genesis Special Polar 0W-30
GENESIS ADVANCED 10W-40
GENESIS GLIDETECH 5W-30
GENESIS POLARTECH 0W-40

Подборка от Eni

i-Sint F 5W-30
i-Sint Tech 0W-30

Подборка от Castrol

Magnatec A5 5W-30
Magnatec 5W-40 A3/B4
Edge Professional A5 5W-30
EDGE Titanium FST 0W-30 A5/B5
EDGE 0W-30
GTX 10W-40 Ultraclean A3/B4
GTX 10W-40 Ultraclean A3/B4
GTX 15W-40 A3/B3
Magnatec 10W-40 R
Stop-Start 5W-30 C3
Vecton 10W-40

Подборка от Fuchs

Titan Supersyn F ECO-DT 5W-30

Подборка от Gulf

Formula FS 5W-30

Подборка от Liqui Moly

Leichtlauf Special F 5W-30
Leichtlauf High Tech LL 5W-30
Leichtlauf High Tech 5W-40
Special AA 5W-30
Special Tec LL 5W-30
Special Tec AA 10W-30
Special Tec V 0W-30
Molygen New Generation 10W-30
Molygen New Generation 5W-30
Molygen New Generation 5W-40
Longtime High Tech 5W-30
MoS2 Leichtlauf 10W-40
MoS2 Leichtlauf 15W-40
Nachfull Ol 5W-40
Optimal 10W-40
Optimal HT Synth 5W-30
Optimal Synth 5W-40
Super Leichtlauf 10W-40
Synthoil Energy 0W-40
Synthoil High Tech 5W-30
Synthoil High Tech 5W-40
Synthoil Longtime 0W-30

Подборка от Motul

8100 Eco-nergy 5W-30
8100 X-lite 0W-30
2100 POWER+ 10W-40
4000 MOTION 15W-40
4100 POWER 15W-50
4100 TURBOLIGHT 10W-40
6100 SAVE-CLEAN 5W-30
6100 SAVE-LITE 5W-30
6100 SAVE-NERGY 5W-30
6100 SYN-CLEAN 5W-30
6100 SYN-CLEAN 5W-40
6100 SYN-NERGY 5W-30

Подборка от NGN

Agate 5W-30
NORD 5W-30
Nord 5W-30
Synergy Plus 0W-30

Подборка от Orlenoil

Platinum MaxExpert F 5W-30

Подборка от Shell

Helix Ultra AF 5W-30
Helix Ultra Professional AV 0W-30
Helix Ultra 0W-30

Подборка от Shell

Helix Ultra AF 5W-30
Helix Ultra Professional AV 0W-30
Helix Ultra 0W-30

Подборка от Statoil

Lazerway F 5W-30

Подборка от Total

Quarz HKS-310 5W-30
Quartz 9000 Future NFC 5W-30
Quartz 9000 0W-30

Подборка от Valvoline

Synpower FE 5W-30
All-Climate 5W-30
Maxlife 5W-30
SynPower FE 0W-30

Подборка от MOL

Dynamic Star 5W-30

Подборка от Wolf

MS-F 5W-30
Vitaltech 5W-30 ASIA-US API SN
OfficialTech MS-F 5W-30

Подборка от Татнефть

Luxe 5W-30
Luxe 5W-40

Подборка от Rosneft

Magnum Maxtec 5w-40
Premium 5W-40
Premium 10W-40
Maximum 5W-40
Maximum 10W-40

Подборка от G-Energy

Expert L 5W40

Подборка от Idemitsu

Zepro Touring 5W-30
Zepro Touring 0W-30 API SN/CF

Подборка от Mobil 1

x1 5W-30
FS 5W-30
Fuel Economy 0W-30

Подборка от Petro-Canada

Supreme Synthetic 5W-30 API SN
Supreme 5W-30 API SN
Supreme Synthetic 0W-30 API SN

Подборка от Pennzoil

Ultra 5W-30 API SN
Ultra Platinum Full Synthetic 5W-30 API SN

Подборка от Kixx

G1 Dexos1 5W-30
G1 5W-30 API SN/CF
G1 0W-30 API SN/CF ILSAC GF-5
NEO 0W-30

Подборка от Hyundai

Xteer Ultra GSL 5W-30

Подборка от ZIC

A 5W-30 API SN
X9 5W-30
X7 FE 0W-30

Подборка от Elf

Evolution 900 SRX 5W-30
Evolution 900 SXR 5W-40
Evolution 900 FT 0W-40
Evolution 900 NF 5W-40
Evolution 700 STI 10W-40

Подборка от Aral

SuperTronic G 0W-30

Eurol

Synergy 0W-30
Superlite Arctic 5W-30
Super Lite 5W-30
Fortence 5W-30
Evolence 5W-30

Я подготовил много тематических рейтингов для своего сайта, основываясь на сравнении отзывов по брендам и сравнивая лабораторные анализы каждой модели. Рекомендую ознакомиться. Лучше один раз увидеть, чем 100 раз услышать. Однозначного ответа никогда не бывает.

Если у Вас уже есть предпочтения в бренде, то все еще проще. Достаточно зайти на любой сервис подбора автомобильных масел нужного бренда и производитель сам подберет масло, которое будет совместимо с вашим мотором. В таблице есть самые популярные бренды и сервисы подбора от этих брендов.
Заходим на любой из сайтов в таблице и выбираем марку, модель авто, двигатель и год выпуска.

Какой бензин, антифриз, масло надо заливать в Весту — советы эксперта

Перечень всех эксплуатационных жидкостей обычно есть в инструкции по эксплуатации. Недавно к нему кое-что добавилось. А еще эксперт «За рулем» рассказал, в каком случае имеет смысл отойти от рекомендаций завода.

Материалы по теме

Лада Веста родилась на АВТОВАЗе в сложное время, когда все явственнее чувствовалось влияние французской платформы Global Access (в прошлом В0), разработанной фирмой Renault. А французы, в свою очередь, используют многие агрегаты фирмы Nissan.

Тем не менее в качестве двигателей использовали вазовские: 21129 и 21179. Коробки передач тоже отечественной разработки — механическая 21807 и роботизированная 21827. Также есть модификация с французской ручной коробкой JR5. А к настоящему времени гамма агрегатов, устанавливаемых на машину, расширилась за счет ниссановского двигателя Н4М и вариатора Jatco JF015e.

Теперь подробно о том, какие жидкости следует применять в тех или иных агрегатах Lada Vesta.

Бензин

Материалы по теме

Завод разрешает заливать в бак неэтилированные бензины с октановым числом по исследовательскому методу 92, 95, 98. Все они, само собой, должны отвечать классу 5. Собственно, других сейчас на бензоколонках как бы и не продают. Заезжать советую только на брендовые колонки. И там выбирайте пистолет с надписью 95. Почему не 92-й? С ним вазовские моторы склонны к детонации. Ну а топливо с октановым числом 98 — неоправданный перерасход средств.

Инструкция к машине говорит то же самое: «Предпочтительным топливом для Вашего автомобиля является бензин с октановым числом 95». Дальше мы далеко не везде будем слепо следовать инструкции, но топливо — это главная движущая сила и главная статья расходов.

Из присадок могу посоветовать использовать осушители топлива — только в зимний период. Все остальное — от лукавого.

Моторное масло

Здесь уже нет никаких «предпочтительных» масел! Во все моторы Весты можно наливать любое масло с уровнем качества по API SL или SM, а также SN. Вязкостные параметры масла завод закладывает тоже чересчур широкие. Лучше ограничиться следующими диапазонами вязкости в зависимости от температуры:

Минимальная температура воздуха, °С	Класс вязкости по SAE	Максимальная температура воздуха, °С
—40*	0W-40	30
—30	5W-30	25
—30	5W-40	35
—25	10W-30	25
—25	10W-40	35

* Жирным шрифтом выделены оптимальные масла для эксплуатации в России.

Если в вашем регионе бывает температура 40°С, то имеет смысл заливать масла типа 5W-50.

Сколько масла нужно для замены?

Для замены масла во всех двигателях следует покупать пятилитровую канистру масла, кроме мотора 21129 со штампованным стальным поддоном, которому достаточно 4 л. При этом мотор Н4М останется без единой капли на доливку.

Менять масло лучше почаще, чем советует инструкция. При тяжелых условиях эксплуатации вдвое чаще — раз в 7500 км. Присадки качественному маслу не нужны.

Антифриз системы охлаждения

С завода залит карбоксилатный антифриз Sintec Antifreeze Lux G12. Цвет антифриза — красный.

Доливать при утечках и ремонтах системы следует такой же. Допустимо применение антифризов других производителей, изготовленных по спецификации G12. Полная емкость системы 7 л, но обычно даже при размыкании всех патрубков достаточно 5 л.

Профилактическая замена охлаждающей жидкости производится через каждые 90 000 км пробега.

Масла и жидкости коробок передач

Материалы по теме

Сервисная книжка к автомобилю рекомендует замену масла в механических и роботизированных коробках передач при пробеге 180 000 км. По опыту эксплуатации автомобилей парка «За рулем» это слишком большой интервал. Коробки в наших условиях нуждаются в обновлении масла каждые 60 000 км.

Масла на замену нужно приобретать 3 литра. Класс качества API GL-4, GL-5. Уровень вязкости SAE 75W80. При использовании качественного масла в присадках необходимости нет.

Все то же можно сказать и про вариатор, у которого замена масла инструкцией не предусмотрена вовсе. Меняя жидкость раз в 60 000 км, вы продлите жизнь дорогостоящего агрегата.

Необходимое количество зависит от метода, примененного при смене. Для максимально полного обновления лучше приобрести две четырехлитровых канистры.

Тормозная жидкость

Инструкция рекомендует замену не реже чем раз в 45 000 км. Заливать можно любую жидкость стандарта DOT-4. Все они полностью совместимы, а тесты, проведенные нашим издательством, говорят, что в сетевых магазинах автозапчастей подделки не попадаются.

Полная емкость системы немного превосходит пол-литра, а потому для качественной замены советую купить один литр жидкости.

Стеклоомывающая жидкость

Емкость бачка — 4,7 л. Во избежание засорения советую заливать жидкость по сезону и через сеточку.

Хладагент системы кондиционирования

Марка указана на табличке под капотом. Замена — только на специализированном оборудовании. А заправить его могут, для справки, 0,475 кг. Это — полная заправочная масса.

Самая простая рекомендация

Заливать в свою машину следует только хорошие жидкости. Не экономьте, и машина долго прослужит вам верой и правдой.

• Самый подробный и честный отчет о четырех годах эксплуатации Весты — тут.

Какое масло лучше залить в мотор авто — полусинтетика, синтетика или другое

Споры о том, какой смазывающий материал выгоднее, идут годами. Существует 3 вида масла, и каждое имеет свои особенности, характеристики, рекомендации к использованию.

Минералка

Этот вид смазки самый дешевый, потому что изготавливается простейшим способом. Средство создает устойчивую масляную пленку, деликатно очищает детали от загрязнений, защищает их от слишком быстрого износа.

Минусы этой смазки заключаются в том, что при низких температурах она слишком быстро загустевает, а значит работа машины находится под угрозой. Также срок годности минеральных масел намного меньше, чем у остальных, поэтому менять его нужно чаще.

Таким образом, с точки зрения экономии денег, это масло не выгоднее, чем синтетика или полусинтетика.

Читайте также

Часто допускаемые ошибки при проверке моторного масла по щупу — что нужно знать
Двигатель, который не обслуживается рпавильно, вряд ли сможет работать долго. Главным показателем здоровья «сердца»…

 

Синтетика

Этот тип масла имеет сложный процесс изготовления. Оно имеет наиболее однородную структуру, что позволяет использовать его для двигателей с большой точностью установки деталей и для новых агрегатов.

Одним из главных плюсов этой смазки является ее долговечность. Синтетика может очень долго выполнять свои функции вне зависимости от внешних факторов.

Однако именно этот плюс становится причиной главного минуса синтетики – большая стоимость. Также не стоит забывать, что иногда в масло рекомендуется добавлять так называемые присадки – специальные добавки, которые улучшают характеристики средства.

Читайте также

Почему современные моторы жрут много масла
При покупке транспортного средства расход масла по сравнению с топливом мало интересует автовладельцев (особенно…

 

 

Полусинтетика

Этот тип масел считается самым выгодным и удобным, потому что полусинтетика – идеальный компромисс между минералкой и синтетикой. Оно намного надежнее и долговечнее, чем минеральные масла.

При этом в нормальном климате оно ничем не уступает синтетике, хотя стоит дешевле.

Индекс вязкости у полусинтетики позволяет использовать ее круглогодично и почти в любом регионе России, поэтому такое средство можно считать универсальным.

Им можно заменить как минеральное, так и синтетическое масло. Полусинтетика хорошо подойдет для дизельных двигателей, при этом ее нужно менять реже, чем минералку, а значит с точки зрения экономии времени и средств полусинтетика даже выгоднее.

Читайте также

Чем отличается масло 10W-40 от 5W-40: основные отличия
Специальные смазочные материалы используют автомобилисты для продолжительной и бесперебойной работы двигателя…

 

Что же выбрать?

В выборе смазки цена продукта не является гарантией того, что он будет идеально служить.

Синтетику нужно покупать только в тех случаях, если это прописано в технических требованиях производителя – машине нужно работать в критически низких температурах или мотор постоянно испытывает сильные нагрузки.

Если зимой температура выше -20, можно использовать полусинтетику. Если зима очень мягкая и морозов больше -15 не бывает, многие используют минеральное масло хорошего качества. Также не стоит использовать синтетику в машинах с большим пробегом.

Минеральные смазки, в сравнении с синтетическими, делают более мягкую очистку. Они поэтапно собирают загрязнения, что намного безопаснее для работы двигателя. Даже некоторые производители машин на заводе заливают в них не синтетику, а минеральные жидкости.

Читайте также

Топ-5 моторных масел для вашего авто
Можно долго выбирать автомобиль с надежным двигателем, но все старания сойдут на нет, если залить в него некачественное…

 

Например, высокотехнологичные японцы используют либо очень качественную минералку, либо полусинтетику. Но в странах СНГ очень часто попадается бензин низкого качества, который может негативно сказаться даже на самой дорогой и качественной смазке.

Подбор смазки должен быть индивидуальным. Цена не имеет значения, потому что материал должен соответствовать режиму работы автомобиля, погодным условиям, величине пробега. Также следует покупать средство только у проверенных продавцов, чтобы не попасть на низкопробную подделку.

https://www.youtube.com/watch?v=6E89tWKe6C0

Подбор масла по автомобилю онлайн: подобрать моторное масло

Подобрать моторное масло по марке автомобиля не всегда просто. Для многих моторов важно не только соответствие формальным параметрам вязкости масла, его класс по API, но и собственные допуски автопроизводителя. Кроме того, дизельные моторы с сажевыми фильтрами нуждаются в специальных малозольных маслах, которые серьезно отличаются по свойствам от обычных моторных масел для дизелей.

Наш каталог подбора масла по автомобилю онлайн сделан с учетом этих требований и позволяет максимально упростить выбор масла. Достаточно знать основные характеристики авто: марку, модель, тип двигателя. Требования к маслу для максимального числа грузовых и легковых машин заложены в интернет-каталог так, чтобы online выбирать наилучшие варианты для каждого двигателя.

Как подобрать масло онлайн

После того как Вы укажете нужные данные, произойдет автоматическая сортировка ассортимента: из всех масел будут представлены те, которые по своим свойствам лучше всего подходят для конкретной машины. Вам останется только выбрать оптимальное из предложенных.

Виды моторных масел

В числе предложенных каталогом масел может оказаться несколько типов смазочных материалов с разным составом. Зная особенность каждого, проще выбрать оптимальное для своих условий эксплуатации.

Синтетическое

Самые дорогие моторные масла, но их стоимость окупается повышенным сроком службы. Ряд современных синтетических автомобильных масел имеет интервалы замены, превышающие 20 тысяч километров. Эта цифра недостижима ни для минеральных, ни для полусинтетических составов.

Синтетические масла отличаются не только долговечностью, но и стабильностью вязкости, превосходно подходят для условий российской зимы. Ряд автомобилей изначально может работать только на чистой синтетике. Это и машины с моторами под энергосберегающие масла с вязкостью типа SAE 0W-20, и дизели с DPF (сажевыми фильтрами).

Полусинтетическое

Полусинтетика – это хороший компромисс, если требования к маслу у автомобиля не так высоки. Хотя полусинтетику и нужно менять чаще, чем синтетику, она стоит дешевле, то есть в общем случае уровень вложений в обслуживание машины может быть даже меньшим. Современные полусинтетические масла отлично подходят для всесезонной эксплуатации, а уровень защитных свойств у них достаточен для большинства бензиновых и дизельных моторов.

Минеральное

Уровень качества минерального масла прямо связан с особенностями нефти, из которой оно вырабатывается. Эти масла наименее дороги, но и их срок службы меньше, чем у других типов. Связано это именно со сложным фракционным составом нефти: даже после очистки и введения стабилизирующих присадок базовое минеральное масло быстрее окисляется, теряет вязкость и способность к смазке.

Минеральные масла лучше всего подходят для умеренного климата и нетребовательных моторов, в основном с большим пробегом. Здесь уже начинает сказываться цена: если у мотора ощутим расход масла на угар, нелогично заливать в него дорогое масло.

Мониторинг структурных изменений микроэмульсий in situ в моделируемых желудочно-кишечных условиях с помощью SAXS и FRET

Abstract

Микроэмульсии представляют собой многообещающие системы доставки лекарств для перорального введения слаборастворимых в воде лекарств. Однако эволюция микроэмульсий в желудочно-кишечном тракте до сих пор плохо изучена, особенно структурные изменения микроэмульсий под действием липазы и слизи. Чтобы лучше понять судьбу микроэмульсий в желудочно-кишечном тракте, мы применили малоугловое рассеяние рентгеновских лучей (SAXS) и флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) для мониторинга структурных изменений микроэмульсий под действием липолиза и слизи.Во-первых, влияние липолиза на микроэмульсии было изучено методом SAXS, который обнаружил образование жидкокристаллических фаз. Между тем, спектры FRET показали, что во время липолиза образовывались мицеллы с меньшим размером частиц, на которые могли влиять CaCl ₂ , соли желчных кислот и лецитин. Затем было изучено влияние слизи на структурные изменения липолизованных микроэмульсий. Результаты SAXS и FRET показали, что жидкокристаллические фазы исчезли и образовалось больше мицелл.Таким образом, мы изучили структурные изменения микроэмульсий в смоделированных желудочно-кишечных условиях с помощью SAXS и FRET и успешно отслеживали появление и исчезновение жидкокристаллических фаз и мицелл.

Графический реферат

Методы малоуглового рентгеновского рассеяния (SAXS) и флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) были применены для мониторинга структурных изменений микроэмульсий под действием липолиза и слизи. Мы обнаружили, что жидкокристаллические фазы и мицеллы появлялись при липолизе, а жидкокристаллические фазы исчезали в слизи.

1. Загрузить: Загрузить изображение в высоком разрешении (295KB)
2. Загрузить: Загрузить полноразмерное изображение

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА

Микроэмульсии

SAXS

FRET

Липолиз

Слизь

Жидкокристаллическая фаза

статьиЦитирующие статьи (0)

© 2018 Китайская фармацевтическая ассоциация и Институт Materia Medica Китайской академии медицинских наук. Производство и хостинг Elsevier B.V.

Рекомендуемые статьи

Ссылки на статьи

FAQ | Эрни Болл Music Man

Axis / Non-Floating Locking Tremolo

Примечания:
Гитара Axis разработана так, чтобы тремоло располагалось ровно на корпусе и позволяло движение только в направлении пикирования.
Поскольку мост ограничен в возможности регулировки поворотными винтами, высота струны в первую очередь регулируется путем добавления или удаления прокладок из кармана шеи. Если вам неудобно снимать гриф с гитары, не пытайтесь установить шайбу заново.Вместо этого отнесите свою гитару к квалифицированному специалисту или обратитесь в службу поддержки клиентов Music Man, чтобы организовать отправку гитары на завод для настройки.
При настройке интонации рекомендуется использовать полноразмерные шестигранные драйверы, желательно с Т-образной рукояткой. Проще всего настроить интонацию с помощью одного 2,5-миллиметрового отвертки, чтобы ослабить / затянуть винт интонации, одновременно используя вторую отвертку для перемещения седла с некоторым натяжением струны на седле.
Имейте в виду, что вся установка Axis в основном сводится к регулировке анкерного стержня и регулировочной шайбе в шейном кармане.Это руководство может показаться чрезмерно обширным, но оно предназначено для подробного описания процессов, необходимых для включения и выключения грифа, работы с механикой блокировки тремоло и т. Д. Основная часть этого руководства предназначена для проверки всех метафорических рамок настройки, которые уже должны быть правильными для большинства гитар и не требуют какой-либо регулировки.

1. Натяните гитару
a. Отрежьте шарик от каждой струны, вставьте обрезанный конец в соответствующее седло и закрепите струну на месте стопорным винтом.
г. Снимите зажимные блоки / винты с гайки и отложите в сторону.
г. Натяните гитару как обычно.
2. Отрегулируйте тонкие тюнеры на мосту так, чтобы они находились в центре их общего хода.
а. Полностью ослабьте один тюнер и полностью затяните следующий. Установите третий тюнер в центре этих двух, а остальные настройте так, чтобы они соответствовали центру.
3. Установите перемычку
a. Настраивайте внутренние 4 струны (A, D, G, B) до тех пор, пока в трем-системе не появится некоторое натяжение струны.
я. Наличие как пружины, так и натяжения струны поможет удержать мост от «подпрыгивания» на поворотных винтах и ​​приближения к его естественному месту покоя при выполнении настройки.
ii. Полное натяжение струны с точной настройкой высоты тона не требуется.
iii. Натяжение прилагается только к внутренним 4 струнам, чтобы не надрезать внешние струны при регулировке поворотных винтов.
г. Отрегулируйте поворотные винты до тех пор, пока мост не станет ровно и ровно на лицевой стороне корпуса.
я. На нижней стороне основной перемычки имеется небольшая фиксирующая пластина.Эта пластина контактирует с лицевой стороной тела. Мост должен ровно прилегать к заднему краю этой пластины.
ii. При подъеме и опускании поворотных винтов задние углы пластины будут:
1. подниматься прямо с корпуса, поднимая поворотный винт с той же стороны
2. подниматься, отталкиваясь от корпуса, поднимая противоположный поворотный винт
iii. Единственные точки, с которыми мост должен соприкасаться, — это два шарнирных винта и задний край небольшой фиксирующей пластины.
г.Переместите трем по всему диапазону движения и убедитесь, что он движется плавно и беспрепятственно.
4. Настройтесь на высоту звука.
5. Убедитесь, что пружины тремоло имеют достаточное натяжение, чтобы при полном натяжении пластина моста не отрывалась от корпуса.
а. Если пластина поднимается, затяните винты тремоло, чтобы добавить соответствующее натяжение пружины.
6. Отрегулируйте анкерный стержень — этот шаг очень важен; все остальные регулировки будут в некоторой степени затронуты, если степень рельефа шеи будет изменена.
а. Удерживайте нижнюю струну «E» на первом и последнем ладах.Вы будете эффективно использовать шнурок как прямую кромку, чтобы увидеть, насколько рельефна шея.
г. Визуально измерьте расстояние между низом струны и верхом струны 7-го лада, если таковое имеется. Если зазора нет, ослабьте регулировочное колесо анкерного стержня до его появления.
г. Затягивайте анкерный стержень, пока гриф не станет плоским, затем слегка ослабьте, чтобы между струной и 7-м ладом оставалось небольшое пространство. Вы можете проверить степень облегчения, нажав на струну во время лада и наблюдая за ее движением относительно ладов.
г. Проведите такую ​​же визуальную проверку и настройку на высокой тетиве «е», чтобы убедиться, что с обеих сторон шеи есть немного лука.
7. Проверьте высоту струны на гайке.
а. Высота стопорной гайки устанавливается с помощью металлических прокладок под гайкой. Маловероятно, что высоту нужно будет регулировать, но не лишним будет подтвердить правильность высоты.
г. Нажмите на любую струну между 2-м и 3-м ладами, чтобы эффективно натянуть струну на 2-м ладу со стороны ореха.
г. Постучите по той же струне поверх струны 1-го лада и обратите внимание на зазор между струной и ладом.
г. Этот промежуток должен быть как можно меньше, чтобы струна не касалась 1-го лада, в то время как 2-й лад удерживается нажатым.
я. Гайку можно установить выше, чтобы предотвратить гудение открытой струны, особенно на басовой стороне.
e. При необходимости открутите гайку с шейки и добавьте или удалите прокладки из-под гайки, чтобы добиться нужной высоты.
я. Заводские прокладки изготовлены из латуни (используются с моделями Axis / EVH 1-го и 2-го поколения с тремоло Gotoh) или из нержавеющей стали (текущего поколения используются с тремоло OEM Music Man).Используемая толщина составляет 0,1 мм и 0,3 мм (0,004 дюйма и 0,012 дюйма соответственно). Хотя рекомендуется использовать заводские прокладки, подойдет любой материал той же формы и толщины.
8. Установите высоту струны / действие.
а. Для всех открытых струн установлено значение 4/64 дюйма (1,6 мм), измеренное на 12-м ладу.
г. Используя линейку 6 дюймов (150 мм), измерьте расстояние от верха проволоки на 12-м ладу до низа каждой струны. Линия 4/64 дюйма должна быть видна под каждой строкой.
г. Если действие велико, в шейном кармане необходима более толстая прокладка.Если низкий, необходима более тонкая прокладка. Незначительную регулировку высоты (менее 1/64 дюйма / 4 мм) можно выполнить с помощью поворотных винтов моста.
я. Бридж можно немного приподнять, чтобы наклонить назад к концевому штифту, но нельзя опустить, чтобы наклонить к звукоснимателям. (Когда бридж установлен слишком низко, он может заклинивать между винтами шарнира и корпусом. Это может привести к заеданию бриджа и не возвращаться к правильной высоте тона после использования тремоло.)
ii. Заводские прокладки представляют собой пластиковые полоски, помещенные между винтами шейки, ближайшими к звукоснимателям, с цветовой кодировкой следующей толщины:
1.Коричневый — 0,010 дюйма
2. Розовый — 0,015 дюйма
3. Желтый — 0,020 дюйма
iii. Перемещение на один размер вверх или вниз обычно регулирует действие немного больше, чем на 1/64 дюйма, и немного меньше, чем на 2/64 дюйма.
1. например, если действие измеряется как 5/64 дюйма с розовой прокладкой, желтая прокладка обычно дает действие немного ниже 4/64 дюйма. Установите желтую прокладку и отрегулируйте шарнирные винты моста немного выше, чтобы получить 4/64 дюйма.
iv. Хотя рекомендуется использовать заводские прокладки, для прокладки шейки можно использовать любой материал той же формы и толщины.
г. Чтобы снять гриф:
1. Поместите сложенный кусок картона между стопорными винтами струны бриджа и корпусом. Картон должен плотно прилегать; его цель — не дать мосту соскочить с седел при снятии натяжения струны.
2. Отключите все струны. При желании можно оставить небольшое натяжение на струнах, чтобы удерживать гриф и тело на месте, когда винты грифа будут сняты.
3. Снимите все пять винтов с шейкой и пластину с шейки.
4. Положите гитару горизонтально вверх.
5. Осторожно вытащите горловину из кармана, стараясь не расслаивать и не отслаивать отделку корпуса вокруг кармана.
6. Снимите установленную прокладку и замените ее на прокладку подходящей толщины.
e. Чтобы заменить гриф:
1. Осторожно опустите гриф обратно в карман (с установленной шайбой нужного размера).
2. Крепко удерживая все соединение грифа, переверните гитару лицевой стороной. Шею следует положить на возвышающуюся поверхность или опору для шеи / колпачок. Поднятие шеи заставляет пятку сжиматься в кармане тела, особенно с некоторым натяжением струн.
3. Установите пластину шейки на место и вставьте винты шейки обратно в корпус.
4. Крепко возьмитесь за гриф, корпус и пластину одной рукой и удерживайте гитару на конце, балансируя на конце штифта.
5. Полностью ввинтите винты с шейкой.
1. Начните с центрального винта на плоской стороне пластины с шейкой, затем с противоположного винта на профилированном крае и закончите тремя внешними. (Такой порядок сводит к минимуму риск растрескивания отделки по углам пластины.)
ii. Убедитесь, что винты шейки не ввинчиваются в корпус.Это может помешать правильной посадке шеи. То есть при вывинчивании шурупов с помощью отвертки или дрели винты должны вывинчиваться из шейки, но вращаться в корпусе. Если винты навинчиваются, отверстия в корпусе можно расширить до диаметра сверла калибра # 19 (0,166 дюйма или 4,25 мм).
9. Установите фиксатор тремоло-пружины
a. На заводе тремоло настроено так, чтобы оно оставалось ровным на корпусе, если нота согнута на полный шаг или меньше.
г. Согните ноту G на 12-м ладу до A и проверьте, поднимается ли бридж.
г. Отрегулируйте пружинный зажим так, чтобы мостик начинал подниматься, когда эта нота сгибается за пределы A.
10. Установите интонацию.
а. Настройте струну на высоту звука с помощью гармоники 12-го лада.
г. Проверьте высоту звука той же ноты на 12-м ладу, но с ладом.
г. Если ладовая нота острее гармоники, длина струны слишком мала, и нужно переместить седло назад в направлении концевого штифта. Если ладовая нота плоская, переместите седло вперед в направлении грифа.
я. Седла фиксирующего тремоло удерживаются на месте винтами с шестигранной головкой 2,5 мм в передней части седла. Чтобы отрегулировать положение седла, ослабьте винт, и седло будет двигаться свободно. Переместите седло в желаемое место и снова затяните винт.
г. Еще раз проверьте примечание и при необходимости отрегулируйте седла.
11. Натяните струны.
12. Установите зажимные блоки / винты на гайку и полностью затяните.
13. Переместите тремоло по диапазону движения и отрегулируйте настройку с помощью тонких тюнеров на мосту.При необходимости разблокируйте гайку, перенастройте стандартными тюнерами и повторите.
14. Дважды проверьте настройку и наслаждайтесь !!
а. Если на первых нескольких ладах (1 ~ 4) слышно жужжание, анкерный стержень необходимо ослабить. Если вы чувствуете гудение в середине грифа (6–10 ладов), анкерный стержень необходимо подтянуть.
г. Если жужжание лада проходит по всей грифе, необходимо увеличить общую высоту струны.

Одномолекулярная динамика FRET молекулярных двигателей в ловушке ABEL

Abstract

Одномолекулярный резонансный перенос энергии Фёрстера (smFRET) молекулярных двигателей обеспечивает трансформирующее понимание их динамики и конформационных изменений одновременно с высоким временным и пространственным разрешением.Однако ключевой задачей таких исследований FRET является наблюдение молекулы в действии достаточно долго, не ограничивая ее естественную функцию. Антиброуновская электрокинетическая ловушка (ловушка ABEL) предназначена для объединения smFRET с молекулярным ограничением, чтобы обеспечить время наблюдения до нескольких секунд, устраняя при этом любое требование привязанного поверхностного прикрепления рассматриваемой молекулы. Кроме того, присущая ловушке ABEL способность избирательно захватывать активные молекулы FRET ускоряет процесс сбора данных.В этой работе мы приводим примеры возможностей ловушки ABEL в выполнении измерений smFRET в расширенном временном масштабе на молекулярном двигателе Rep, что имеет решающее значение для удаления белковых блоков перед продвижением механизма репликации ДНК и для перезапуска остановившейся репликации ДНК. Мы можем контролировать отдельные молекулы Rep до 6 с с временным разрешением менее миллисекунды, фиксируя множественные события конформационного переключения в течение времени наблюдения. Здесь мы предлагаем пошаговое руководство по рациональному проектированию, созданию и реализации ловушки ABEL для smFRET обнаружения Rep in vitro .Мы включаем подробную информацию о том, как моделировать электрический потенциал в месте ловушки, и использовать скрытый марковский анализ траекторий smFRET.

1. Введение

Область биофизики одиночных молекул находится в авангарде современных научных инструментов, позволяя описывать самые строительные блоки человеческой жизни с деталями, намного превосходящими те, которые получаются с помощью ансамблевых методов [1]. Несмотря на то, что ансамблевые измерения быстрые и эффективные, они всегда дают усредненную картину: переходные промежуточные конформации и динамика часто скрыты.Извлечение значимых данных из отдельных молекул в сложных жидких средах по своей сути является сложной задачей, но предлагает вознаграждение в виде доступа к молекулярной динамике, функции белков и молекулярной гетерогенности [2, 3]. Инструменты флуоресцентной микроскопии оказались неоценимыми для извлечения деталей на молекулярном уровне [4], при этом конфокальная микроскопия и микроскопия полного внутреннего отражения (TIRF) в сочетании с переносом энергии Ферстера (FRET) в настоящее время являются наиболее распространенными методами [5].

При биомолекулярных измерениях FRET эффективность безызлучательного переноса энергии между возбужденным донорным флуорофором и акцептором, E _FRET , количественно описывает расстояние между ними R, обычно в диапазоне 1 -10 нм [6]. Дано E _FRET = 1 / (1+ ( R / R ₀ ) ⁶ ), где R ₀ — расстояние между флуорофорами, когда E _FRET = 0.5, колебания измеряемой эффективности FRET в реальном времени могут быть коррелированы с конформационной динамикой внутри отдельных флуоресцентно меченых биомолекул [7]. Основным отличительным признаком подхода FRET является способность выявить распределение популяций на расстояниях между красителями и выявить временные конформации, которые в противном случае могут быть скрыты обычным усреднением по ансамблю. В сочетании со способностью исследовать отдельные молекулы в течение длительных периодов времени (от секунд до минут) с миллисекундным временным разрешением, подход FRET был успешно применен для выявления конформационной динамики в широком диапазоне белков [8], нуклеиновых кислот [9–11]. ] и биомолекулярных комплексов [12–14].Однако необходимо сделать выбор между исследованием свободно диффундирующих молекул в течение изначально короткого времени наблюдения или продления этого времени наблюдения за счет потенциального нарушения биологической функции за счет прикрепления молекул к поверхности. Тесты прикрепления работают для некоторых систем, но поиск комбинации FRET-меток и стратегии прикрепления, которая не препятствует работе рассматриваемой молекулы, является нетривиальной задачей [15, 16].

Для устранения этих ограничений и наблюдения за белками и молекулярными двигателями в действии в последнее десятилетие набирает силу растущая область исследований, посвященных разработке средств удержания одиночных молекул [17–19].Задача состоит в том, чтобы контролировать один белок — обычно с эффективным диаметром 5-10 нм — достаточно долго, чтобы обнаруживать конформационные изменения в течение одного реакционного цикла его естественной функции, избегая при этом необходимости иммобилизации поверхности. Белок диффундирует в 10 раз быстрее, чем типичный вирус, например, потому что скорость его броуновской диффузии обратно пропорциональна его гидродинамическому радиусу, как моделируется соотношением Стокса-Эйнштейна. Кроме того, одиночные молекулы обычно маркируются только одним флуорофором, таким образом выделяя ограниченное количество фотонов для сбора.Таким образом, основные задачи заключаются в следующем: 1) обнаружить быстро движущуюся молекулу с временным разрешением менее миллисекунды, 2) удерживать ее на месте в пределах области пространства, эффективный масштаб длины которой составляет субмикрометр, и 3) зафиксировать конформацию. изменения, а также другие молекулярные свойства. В настоящее время наиболее перспективными доступными ловушками для одиночных молекул являются антиброуновская электрокинетическая ловушка (ABEL-ловушка) [20–23], геометрическая электростатическая ловушка для жидкости [24] и оптическая ловушка с самоиндуцированным обратным действием [25].Только первые два метода продемонстрировали удерживание в растворе молекул размером с отдельные флуорофоры.

В дополнение к ограничению одиночной молекулы в области наблюдения, ловушка ABEL обеспечивает доступ к фотофизическим свойствам флуоресцентных меток и облегчает гидродинамическое профилирование отдельных молекул [26–28]. Например, измерение константы диффузии молекулы D и электрокинетической подвижности μ позволяет нам наблюдать связывание отдельных молекул с ДНК [20, 23].Регистрация яркости флуоресценции, времени жизни, анизотропии и спектральной информации позволила изучить индуцированные светом конформационные изменения и эффекты олигомеризации белка фотосинтетической антенны аллофикоцианина [28, 29], комплекса пигмент-белок антенны C-фикоцианин [30], а также выделить между одно- и двухцепочечными молекулами ДНК в смеси [31]. Ловушка ABEL оказалась отличным инструментом для исследования окислительно-восстановительного цикла в мульти-медном ферменте bNiR [32] и гидролиза АТФ в мульти-субъединичном ферменте TRiC [33] посредством изменения интенсивности флуоресценции.Комбинация FRET и ABEL захвата одной молекулы предлагает новый подход к доступу к динамике изменений конформации, связанных с отдельными молекулами, с точностью, близкой к дробовому шуму [34]. Это особенно многообещающе для мониторинга сложной динамики нескольких субъединиц одиночных молекулярных моторов.

Здесь мы исследуем конформационную динамику одиночных Rep молекул в самодельной ловушке ABEL (Figure 1) (система, разработанная ранее в лаборатории Michael Börsch, Universitätsklinikum Jena, Германия) [35–37].Молекулярные моторы хеликазы необходимы во всех аспектах метаболизма нуклеиновых кислот, гидролизующих нуклеозидтрифосфаты (NTP) (обычно АТФ), чтобы генерировать энергию для направленной транслокации вдоль цепи нуклеиновой кислоты [38-40]. Транслокация обычно происходит в одну или две основные стадии на гидролиз каждого нуклеотидтрифосфата, нарушая водородные связи между комплементарными основаниями на каждой стадии [41, 42]. In vivo нуклеиновые кислоты связаны белками, которые должны одновременно удаляться во время разделения цепи [43], что делает процесс намного более сложным, чем простое нарушение спаривания оснований.Геликазы способны использовать избыточную свободную энергию, полученную в результате гидролиза NTP и разделения пар оснований, для создания силы, чтобы проталкивать белки вдоль ДНК [44–47]. Обычно предполагалось, что таким образом белки вытесняются из ДНК, однако фактический метод вытеснения белков еще предстоит выяснить. Чтобы осуществить транслокацию, геликазы претерпевают молекулярные конформационные изменения, и поэтому являются хорошими экспериментальными образцами для оптимизации биофизических методов, которые предназначены для изучения переключения между различными молекулярными состояниями.

Рис. 1. Схема ловушки ABEL.

Лазер возбуждения (зеленая точка) сканирует заранее заданный шаблон в пределах области захвата. Флуоресценция, испускаемая захваченной молекулой Rep в конфокальной ловушке ABEL, обеспечивает сигнал FRET молекулы и информацию о положении. Это основа для расчета напряжения обратной связи, необходимого для создания электрофоретической силы, которая толкает молекулу к центру ловушки.

Дополнительные репликативные геликазы необходимы в клетках для того, чтобы способствовать прогрессированию бактериального аппарата репликации, называемого реплисомой [48], посредством нуклеопротеиновых комплексов, которые в противном случае блокировали бы репликацию [49–55].Rep представляет собой вспомогательную репликативную геликазу в бактериях Escherichia coli , которая удаляет белковые блоки репликации ДНК, связанные с ДНК, а также помогает перезапустить остановившийся репликационный аппарат [56]. Он содержит четыре субдомена (1A, 2A, 1B и 2B), из которых 2B может вращаться вокруг шарнирной области, обеспечивая значительные конформационные изменения в белке [39, 40, 57–62] (см. Рисунок 2). Как хеликаза 1A суперсемейства, Rep имеет 3’-5 ’направленность и, как таковой, вероятно, смещает комплексы нуклеопротеидов перед продвигающейся репликационной вилкой на матрице ведущей цепи ДНК [49, 51].

Рис. 2. Кристаллические структуры Rep Helicase.

Rep содержит 4 субдомена: 1A (желтый), 1B (зеленый), 2A (пурпурный) и 2B (синий). Видно, что в его кристаллических структурах Rep занимает как а) открытую, так и б) закрытую конформацию, в которой субдомен 2B повернулся примерно на 130, 90, 134, [60]. Расположение прикрепленных красителей — Alexa Fluor 546 и Alexa Fluor 647 -, используемых в этом исследовании, обозначено пурпурными звездами и оранжевыми кружками соответственно. Размещение красителей в положениях A97C и A473C через малеимидную связь позволяет использовать FRET в качестве линейки наноразмеров для измерения расстояния между остатками на субдоменах 1B и 2B (PDB ID: 1UAA).

Ключевыми факторами в определении эффективности репликации ДНК являются частота и продолжительность паузы реплисом и заикания. Доступ к движению и динамике геликазы с помощью FRET в качестве линейки наноразмеров обеспечивает доступ к этим величинам на основе отдельной молекулы. В частности, маркировка Rep в положениях 97 (субдомен 1B) и 473 (субдомен 2B) донорными (например, Alexa Fluor 546) и акцепторными (например, Alexa Fluor 647) флуорофорами дает возможность обнаруживать конформационные переходы в субдомене 2B (рис. 2). .Позиции 97 и 473 в Rep были ранее помечены как индивидуально [63], так и тандемно [61] и не влияли на функциональность белка. Эти измерения с высоким разрешением потенциально раскрывают правила перехода субдомена Rep 2B между открытыми и закрытыми состояниями, количество состояний и то, сдвигает ли присутствие кофакторов конформационное состояние. На сегодняшний день эти типы измерений требуют иммобилизации геликазы на субстрате [61], что, по нашему собственному опыту, может привести к нарушению функциональной активности, а также к возникновению искусственных фотофизических эффектов из-за близости к поверхности.Напротив, улавливание Rep-молекул в ловушку ABEL позволяет проводить измерения smFRET вдали от любых границ раздела в растворе в течение продолжительных периодов времени.

Здесь мы описываем протокол для создания и реализации ловушки ABEL для идентификации нескольких конформационных состояний в молекулярной машине, на примере отдельных молекул Rep с использованием smFRET. Мы ожидаем, что эта процедура может открыть платформу для исследования мутаций Rep в частности, а также динамических молекулярных машин и их взаимодействия в растворе в целом.

2. Методы и материалы

2.1. Очистка и маркировка Rep

Ген rep , лишенный всех нативных остатков цистеина и с ненативными цистеинами, введенными вместо аланина 97 и аланина 473, был клонирован в pET14b таким образом, что он находился в рамке с гекса-гистидиновой меткой, создавая плазмида pJLh235. Rep был сверхэкспрессирован и очищен с использованием pJLh235, как ранее было опубликовано для WT с his-tagged Rep [64]. Короче говоря, белок был сверхэкспрессирован из E.coli с использованием 0,2% арабинозы при 20 ° ° C в течение двух часов перед тем, как полученный осадок клеток хранился при -80 ° ° C. Осадок клеток лизировали с использованием лизоцима и гексадецилового эфира полиэтиленгликоля Brij 58 перед Polymin P и аммонием. сульфатные осадки. Полученный супернатант затем очищали с использованием 5 мл неочищенной колонки HisTrap FF и 3 мл колонки с гепарин-агарозой. Затем белок был помечен с использованием следующей адаптированной версии опубликованного метода [65].

1. Собирают фракции, содержащие чистый Rep, по результатам измерения поглощения при 280 нм и SDS-PAGE, и восстанавливают в течение двух часов при 4 ° ° C путем добавления 5 мМ трис (2-карбоксиэтил) фосфин гидрохлорида (TCEP).

2. Добавить сульфат аммония до 70% насыщения при перемешивании при 4 ° ° C. Продолжать перемешивание еще 10 минут.

3. Осадок осаждают центрифугированием при 18 000 g в течение 20 минут при комнатной температуре. Ресуспендируйте осадок в дегазированном буфере для маркировки (100 мМ фосфат натрия pH 7,3, 500 мМ хлорид натрия, 20% (об. / Об.) Глицерин).

4. Alexa Fluor 546 C ₅ Maleimide и Alexa Fluor 647 C ₂ Maleimide (оба Invitrogen A10258 и A20347 соответственно) растворяли в безводном диметилсульфоксиде (DMSO) и смешивали в эквимолярных количествах.Мы отмечаем, что хотя существует широкий спектр органических красителей для маркировки репов, пара FRET Alexa546 и Alexa 647 демонстрирует более низкую гидрофобность по сравнению со спектрально схожими производными Atto [66] и расширяет диапазон FRET за пределы 10 нм из-за расстояния Ферстера, равного 7,4 нм.

5. Добавить смешанные красители к Rep при 5-кратном молярном избытке при перемешивании встряхиванием при комнатной температуре в течение 30 минут. Малеимидные группы, присутствующие в красителях Alexa Fluor, ковалентно связываются с тиоловыми группами (присутствующими на остатках цистеина) высокоселективным образом.Реакцию мечения гасят добавлением 10 мМ 2-меркаптоэтанола и встряхивание продолжают еще 10 минут.

6. Свободный краситель отделяют от меченого Rep с использованием 1 мл неочищенной колонки HisTrap FF. Колонку уравновешивают буфером A (20 мМ Трис-HCl pH 7,9 и 500 мМ NaCl, 20% (об. / Об.) Глицерина) + 5 мМ имидазол перед загрузкой смеси краситель / белок.

7. Промойте колонку 20 мл буфера A + 5 мМ имидазола перед проявлением с градиентом 20 мл от буфера A + 5 мМ имидазола до буфера A + 500 мМ имидазола.

8. Соберите фракции пиков, содержащие меченый Rep и пул, аликвотируйте и храните при -80 ° C в 20 мМ Трис-HCl pH 7,9 и 500 мМ NaCl, 30% (об. / Об.) Глицерине.

9. Конечная концентрация белка измеряется с помощью анализа Брэдфорда, а концентрация красителя измеряется с помощью NanoDrop 2000 (Thermo Scientific ™). Эффективность маркировки можно рассчитать как 100 * ([dyeA] + [dyeB]) / (2 * [белок]). В этом случае эффективность мечения составляла ~ 85% с коэффициентами экстинкции Alexa Fluor 546 при 93000 см ^-1 M ^-1 и Alexa Fluor 647 при 265000 см ^-1 M ^-1 .

Все химические вещества были приобретены у Sigma Aldrich, если не указано иное.

2.2 Ловушка ABEL

2.2.1 Основной принцип и моделирование электрического поля

Основной принцип ловушки ABEL основан на электрофорезе: создание электрофоретической силы для перемещения молекулы с зарядом q по желаемому пути путем воздействия на нее пространственно однородное электрическое поле. Полная электрокинетическая сила представляет собой комбинацию электрофоретических и электроосмотических сил, действующих на поверхностный заряд молекулы или всего буферного раствора соответственно.В отличие от диэлектрофореза [67, 68], электрофорез является полевым эффектом первого порядка и поэтому особенно подходит для приложения сил к заряженным наноразмерным объектам. Мы моделируем электрическое поле для нашей конкретной геометрии чипа, чтобы оценить его однородность по всей области захвата. Это вызывает необходимость в инструменте моделирования электродинамики, доступном далеко не каждому. Мы предлагаем альтернативный подход, использующий известную математическую аналогию между электростатикой и установившейся теплопроводностью [69].Большинство инструментов анализа методом конечных элементов включают анализ теплопроводности в качестве стандартной функции, неявно предоставляя инструменты для моделирования электрического поля.

Аналогия между электростатикой и теплопроводностью очевидна, но мы подчеркиваем, что это математическая, а не физическая аналогия. В таблице 1 проводится аналогия и дается обзор того, как мы заменили электростатические переменные теплопроводности. Электрический потенциал φ и температурное поле T соответствуют, поскольку закон Гаусса и Первый закон термодинамики определяют идентичные уравнения в частных производных.Электрическое смещение и тепловой поток дают аналогию между диэлектрической проницаемостью ε и теплопроводностью k. Кроме того, необходимо учитывать граничные условия на границах раздела материалов. В частности, нормальные компоненты электрического смещения и электрического потенциала φ должны быть непрерывными, что мы переводим на постоянную температуру T и нормальные компоненты теплового потока через границы раздела фаз.

Таблица 1. Аналогия между электростатикой и теплопроводностью.

В инструменте моделирования значения электрического потенциала φ на электродах должны быть установлены как значения температуры T. Диэлектрическая проницаемость ε каждой области должна быть введена как теплопроводность k. Значения результирующего температурного поля T фактически являются значениями электрического потенциала φ, которые можно использовать для расчета электрического поля

Мы демонстрируем этот метод с помощью ANSYS Workbench для двухмерной горизонтальной плоскости через ловушку (рис. 3). Мы используем MATLAB (Mathworks) для постобработки данных, т.е.е. расчет электрического поля по уравнению 1.

Рис. 3. Моделирование электрического поля внутри ловушки ABEL.

a) Напряжение обратной связи устанавливается равным +1 В и -1 В поперек направления x, что приводит к однородному электрическому полю в области захвата, как показано крупным планом центральной области, показанной на b). c) Однородные электрические поля вдоль направлений x и y накладываются друг на друга, что приводит к диагонально ориентированным параллельным силовым линиям в зоне захвата для одновременного приложения ± 1 В по x и y (увеличенное изображение показано на d).

Мы приняли следующий рабочий процесс:

1. Геометрия конструкции путем указания областей электродов, PDMS (полидиметилсилоксановый эластомер) и буферного раствора.

2. Установите граничные условия: установите значения температуры в положениях электродов, которые соответствуют приложению напряжения к электродам.

3. Смоделируйте температурное поле, соответствующее электрическому потенциалу.

4. Рассчитайте электрическое поле согласно и выведите соответствующие силовые линии на этапе постобработки в MATLAB.

Результаты моделирования электрического поля в нашей ловушке ABEL представлены на рисунке 3 с типичным напряжением обратной связи ± 1 В и относительной электрической проницаемостью ε _r = 3 для PDMS, ε _r = 80 для воды. и ε _r = 1 для воздуха. Сначала мы рассмотрим одномерный случай приложения напряжения обратной связи +1 В на левом электроде и -1 В на правом электроде (рис. 3 a, b). Это создает электрическое поле, которое является однородным в центральной области захвата, как показывают параллельные силовые линии (белые).На практике напряжение обратной связи прикладывается к направлениям x и y одновременно с наложением результирующих электрических полей. Пример показан на рис. 3 c, d): мы прикладываем ± 1 В в направлениях x и y, что приводит к диагональному однородному электрическому полю (параллельные силовые линии в центре ловушки), подходящему для приложения силы к заряженной молекуле в обоих направлениях. x и y одновременно. Наш анализ здесь можно сравнить с более упрощенной моделью, которая ранее была опубликована в ссылке [36].

2.2.2 Улавливание обратной связи и приборы

Мы реализовали ловушку ABEL в конфокальной установке smFRET с объемом возбуждения лазера, добавив специально созданный блок лазерного сканирования для управления лучом и микрожидкостный чип с платиновыми электродами. Микрофлюидный чип играет центральную роль в удерживании образца, содержащего молекулы Rep в растворе, и создании электрического поля для захвата ABEL, как описано в разделе 2.2.1. Этот сборный чип изготовлен из кварца (плавленый диоксид кремния) или чипа PDMS (полидиметилсилоксановый эластомер) с рисунком, прикрепленного к покровному стеклу микроскопа.Кварцевые чипы имеют отличное соотношение сигнал / шум, поскольку фон от автофлуоресценции в кварце значительно ниже по сравнению со стандартными стеклянными покровными стеклами. Производство кварцевой крошки относительно дорогое, поэтому ее часто очищают и повторно используют многократно. Может потребоваться пассивация поверхности путем нанесения многослойного покрытия для предотвращения адсорбции молекул на кварцевые стенки [70].

Самым большим преимуществом микросхем PDMS является простота использования. Их быстрое и дешевое воспроизведение делает их одноразовыми, поэтому нет необходимости в агрессивных процедурах очистки.Что еще более важно, до процесса соединения покровное стекло и микросхема PDMS находятся в вакууме для плазменной очистки. Этот этап вакуумирования удаляет все хранящиеся газы из микросхемы PDMS. Затем PDMS может реабсорбировать пузырьки воздуха, образующиеся при заполнении чипа аналитом. В этом эксперименте мы использовали чип, сделанный из PDMS с рисунком, прикрепленный к стандартному покровному стеклу микроскопа (24 × 32 мм, Roth, толщина # 1). Мы приобрели индивидуальную пластину маски (Microfluidics Work Group, IPHT Jena) с желаемыми размерами и рисунком для 26 чипов размером 1.Диаметром 5 см каждая. Протоколы, используемые для создания дизайна паттернов, были описаны и применялись в других источниках [35–37, 71, 72]. Мы используем метод изготовления и обращения с чипом, аналогичный тому, который был предложен в предыдущих публикациях [70, 73, 74], и измеряли высоту центральной области захвата, которая составила 600 нм [27].

В основе нашей установки лежит программируемая вентильная матрица (FPGA 7852R, National Instruments): система управления с обратной связью в реальном времени, запускающая лазерное сканирование и вычисление необходимых напряжений обратной связи для захвата молекулы в соответствии с ее положением.Мы адаптировали ранее опубликованное программное обеспечение для реализации возможностей захвата ABEL на FPGA с помощью модуля LabVIEW FPGA [20]. Лазер возбуждения в ловушке ABEL перемещается по заранее заданному шаблону, большему, чем фокус луча, чтобы определить положение молекулы для захвата. Из-за степени и скорости броуновского движения белков и объектов размером менее ∼100 нм отслеживание с помощью видеокамеры происходит слишком медленно [22, 75]. Стандартная конфокальная система определяет наличие флуоресцентной молекулы в фокусном объеме возбуждающего луча, но предел разрешения не позволяет нам узнать ее точное положение.Создание нескольких участков обнаружения, разбросанных в пространстве с помощью лазерного сканирования, позволяет нам получить доступ к местоположению рассеивающейся молекулы, сохраняя при этом отличное соотношение сигнал / шум конфокальной системы. Поскольку зарегистрированные флуоресцентные фотоны и выполнение лазерного смещения имеют временную метку, мы можем определить положение молекулы в месте захвата (рис. 4).

Рисунок 4: Основной принцип ловушки ABEL.

a) Лазер возбуждения сканирует заранее заданный шаблон из 32 точек на частоте 7 кГц (постоянный 4.5 мкс в каждой точке), в то время как фотоны флуоресценции с меткой времени, исходящие из этой области сканирования, предоставляют информацию о положении молекулы, которую необходимо уловить. б) ПЛИС управляет лазерным сканированием, оценивает положение молекулы с помощью фильтра Калмана, включая транспортные параметры (D, μ), и в) посылает необходимые напряжения обратной связи, создающие электрокинетическую силу, чтобы захватить молекулу в центре диаграммы сканирования . г) Расчетная усредненная по времени картина интенсивности для всего участка ловушки.

Для того, чтобы ловушка ABEL работала с одиночными молекулами, определение положения, основанное только на положении лазера, недостаточно точно; перетяжка лазерного фокуса имеет поперечный диаметр, который на два порядка больше, чем типичный эффективный диаметр захваченной молекулы, и молекула также продолжает совершать броуновское движение между этапами сканирования.Увеличение скорости сканирования ограничено характеристиками блока управления лучом (см. Раздел 2.2.3) и отношением сигнал / шум. Уменьшение скорости сканирования улучшает отношение сигнал / шум до точки, где размытость движения становится очевидной [76]. Для достижения требуемой точности определения местоположения мы реализовали фильтр Калмана [20, 77]: стандартный инструмент для измерения зашумленных данных в сочетании с известной динамикой системы — в нашем случае броуновским движением и электрокинетическим откликом. Этот фильтр оценивает положение молекулы в ловушке ABEL на основе обнаруженных фотонов, положения лазера и предсказания броуновского движения молекулы с учетом ее предполагаемого коэффициента диффузии D и электрокинетической подвижности μ.Затем фильтр взвешивает информацию о местоположении необработанных данных (количество фотонов) с оценкой местоположения на основе транспортных параметров ( D, и μ) для прогнозирования обновленной оценки местоположения (рисунок 4c). Чтобы преодолеть ограничения фильтра Калмана фиксированных параметров модели ( D , μ), можно расширить его, используя инновационное отбеливание, включая фоновый шум с помощью оценщика максимального правдоподобия, и, таким образом, достичь полного онлайн-определения D и в реальном времени. μ, как показано в [23, 72].

Детали нашего оборудования следующие (Рисунок 5):

Рисунок 5. Схема установки светового микроскопа с реализованной ловушкой ABEL. Телескопы

(L ₁ -L ₆ ) переключают плоскости сопряжения и регулируют диаметр луча перед попаданием в линзу объектива (O). Соотношения, указанные рядом с телескопами, указывают соотношения фокусных расстояний линз телескопа, передающих сопряженные плоскости пути лазерного луча. Вверху слева: управление лучом лазерного возбуждения, нижнее синее поле: обнаружение флуоресценции одиночных фотонов.

Линейно поляризованный пучок непрерывного возбуждения 532 нм проходит полуволновую пластину и светоделительный куб (AHWP05M-600, PBS201, Thorlabs) для регулировки мощности лазера до 20 мкВт перед попаданием в электрооптические дефлекторы (EOD, M310A, Conoptics) создание шаблона сканирования на месте ловушки. Дихроичный светоделитель (z 532 RD, AHF) внутри корпуса промышленного инвертированного микроскопа (IX71, Olympus) направляет возбуждающий лазер в линзу объектива микроскопа (60x, масляная иммерсия, PlanApo N, NA 1.42, UIS2, Olympus), позволяя возвращающейся флуоресценции одновременно проходить на путь детектирующего луча. Точечное отверстие 300 мкм (P300D, Thorlabs) в первой плоскости изображения после линзы трубки больше по сравнению со стандартной конфокальной установкой, чтобы не обрезать какой-либо расширенный шаблон лазерного сканирования ловушки. Второй дихроичный светоделитель (F48-640, AHF) спектрально разделяет донорные и акцепторные фотоны по направлению к их соответствующему лавинному фотодиоду (APD SPCM-AQRH 14, Excilitas). После прохождения дополнительных фильтров (донорская полоса пропускания: F37-582 / 75, акцепторная полоса пропускания: F46-647, оба AHF) карта TCSPC (коррелированный по времени подсчет одиночных фотонов) (SPCM, DPC230, Becker & Hickl) и FPGA (7852R, National Instruments) одновременно обнаруживает донорные и акцепторные фотоны.Карта TCSPC отмечает входящие фотоны для дальнейшего анализа временной трассы. Мы извлекли записанные всплески одиночных молекул с помощью собственного программного обеспечения, содержащего встроенный скрипт C в MATLAB (Mathworks).

FPGA оценивает положение захваченной флуоресцентной молекулы с помощью фильтра Калмана и подает соответствующее напряжение обратной связи, чтобы удерживать ее в ловушке. Усилитель напряжения обратной связи (V _PP = 20 В, рабочая частота 80 МГц) соединяет выход обратной связи FPGA с четырьмя платиновыми электродами, создавая электрическое поле для захвата молекулы в микросхеме микрофлюидики.Пьезоэлемент (P-527.3CD, Physik Instrumente) удерживает микрожидкостный чип и позволяет нам точно регулировать осевое положение (пространственное разрешение 0,1 нм, повторяемость ± 1 нм по оси z) вдоль распространения возбуждающего лазера. Перед началом эксперимента мы используем камеру EMCCD (iXon ^{EM +} DU-897, Andor Technology), чтобы выровнять чип по лазерной схеме захвата путем вставки светоделителя 50/50 в путь луча, который впоследствии выводится из путь детектирующего луча снова.Источником освещения служит стандартная галогенная лампа.

2.2.3 Регулировка возбуждающего луча и управление лучом

Управление лучом в ловушке ABEL требует быстрого и точного метода лазерного сканирования. Хотя существует множество возможностей — от гальванических зеркал до пространственных модуляторов света — требования к скорости сужают наши возможности до двух устройств: электрооптических дефлекторов (EOD) и акустооптических дефлекторов (AOD). AOD имеют большие углы отклонения и являются более экономичным выбором.Они модулируют показатель преломления прозрачного кристалла акустическими волнами (применяя радиочастоты (RF) к кристаллу). Скорость отклонения луча зависит от диаметра луча (чем меньше, тем быстрее), с использованием продольных (более быстрых) или поперечных волн, а также от того, осуществляется ли обращение к ВЧ-синтезатору с помощью аналогового генератора управления напряжением или прямого цифрового синтеза (быстрее). Кроме того, эффективность дифракции снижается для больших углов (максимальная ширина полосы модуляции) на практике до 50%, что необходимо скорректировать для однородного освещения всей картины захвата [70].

Электрооптические дефлекторы (EOD) быстрее, чем AOD, и работают на основе эффекта Поккельса, который изменяет оптические свойства электрооптического кристалла в ответ на приложенное электрическое поле. Угол отклонения не зависит от длины волны, как в AOD, а является функцией дисперсии показателя преломления и, следовательно, постоянным в видимом диапазоне длин волн. EOD отклоняют весь луч с эффективностью передачи, не зависящей от угла отклонения, и они позволяют лучу проходить прямо насквозь, когда они выключены.Эти свойства упрощают настройку нескольких длин волн возбуждения с помощью EOD. Хотя они, как правило, имеют меньший угол отклонения по сравнению с AOD, при больших углах отклонения не происходит уменьшения интенсивности, что делает поправку на однородную картину возбуждения излишней.

Мы используем пару связанных EOD (M310A, Conoptics) в сочетании с широкополосными усилителями мощности (7602M, Krohn-Hite Corporation), обеспечивающими необходимое высокое напряжение (± 200 В). Заявленный угол отклонения 1,5 мкм / В при апертуре 2.5 мм позволяет нам создать рисунок размером 2,3 мкм x 2,3 мкм с 6 разрешимыми пятнами вдоль направлений x и y в плоскости нашего образца. В этом эксперименте мы выполняем ловушку с помощью EOD на частоте 7 кГц. Более быстрое сканирование требует лучшего отношения сигнал / шум, чтобы иметь возможность достаточно точно определить положение молекулы, чтобы уловить ее. После принятия решения о системе управления лучом единственным свободным параметром, определяющим размер диаграммы и количество разрешимых пятен, является диаметр луча. Уменьшение диаметра лазерного луча приводит к большему углу дифракции, но ограничивает количество разрешимых пятен и увеличивает перетяжку луча в плоскости образца.Лучший способ определить требуемый диаметр входящего луча — начать с перетяжки луча и диапазона Рэлея в плоскости образца и вернуться к лазерному источнику.

На рис. 4а) показан предполагаемый шаблон сканирования: шаблон обхода Найта с 32 точками, разделенными по диагонали на 0,47 мкм. Схема обхода Рыцаря может завершать закрытый обход всех точек (заканчивающихся и начинающихся в одной и той же точке) при посещении всей области захвата в течение одного сканирования (в отличие от сканирования змеи, которое начинается с одной стороны и заканчивается на противоположной стороне) и был впервые продемонстрирован Wang et al.[78]. Чтобы создать однородную интенсивность возбуждения по всей области захвата, мы стремимся к перетяжке пучка ω _b = 0,5 мкм. Ловушка ABEL активно ограничивает броуновское движение молекулы по осям x и y, ограничивая ее движение по оси z физическими пределами микрожидкостного чипа. Следовательно, конфокальный параметр b луча должен оставаться постоянным по всей высоте чипа для получения одного и того же сигнала флуоресценции независимо от фактического положения молекулы по оси z вдоль луча возбуждения.Это условие выполняется при конфокальном параметре b = 2,95 мкм, полученном удвоением диапазона Рэлея (b = 2Πω _b ² / λ).

Для определения диаметра луча d = 2ω _i , входящего в объектив нашего микроскопа, мы аппроксимируем распространение гауссова луча через линзу для малых углов с помощью [79]

Фокусное расстояние объектива рассчитывается с помощью f _obj = f _tubelens / ℳ (при увеличении объектива ℳ ), в нашем случае f _obj = 3.33 мм, что приводит к требуемому диаметру луча d = 1,13 мм (обратите внимание, что эта обратная зависимость между шириной входного луча и выходной шириной в образце также используется в микроскопии одиночных молекул Slimfield [80]). Вышеприведенное уравнение для коллимирования гауссова пучка справедливо, только если ω _i >> ω _b и если ω _i >> λ — требование параксиального приближения. Хотя эти уравнения дают только оценки, их обычно достаточно, и размер луча можно легко настроить с помощью подходящего кеплеровского телескопа.Наиболее важным аспектом использования телескопов является ретрансляция сопряженных плоскостей. Во-первых, это важно для отображения отклонения луча по оси x на отклонение по оси y и далее в плоскость захвата, чтобы гарантировать, что манипуляции с лучом по обеим осям находятся в одной плоскости, создавая шаблон сканирования 2D (линзы L ₁ и L ₂ на рисунке 5). Во-вторых, нам нужно обеспечить, чтобы луч всегда попадал в заднюю апертуру объектива. Путем передачи сопряженных плоскостей отклонения x и y на заднюю апертуру объектива изменяется только угол луча, входящего в объектив, но не его пространственное положение.Задняя апертура объектива — это плоскость Фурье плоскости нашего образца, переводящая угловое отклонение в боковое движение. Дополнительный телескоп на нашем пути луча (линзы L ₃ и L ₄ на рисунке 5) помогает выровнять всю систему. Это дает нам еще одну сопряженную плоскость, расположенную непосредственно на зеркале, чтобы точно выровнять фокус луча без необходимости перестраивать остальную часть пути луча. Последний телескоп (линзы L ₅ и L ₆ на рисунке 5) передает сопряженную плоскость этого зеркала управления лучом на заднюю апертуру объектива.

Мы приняли следующую процедуру для калибровки шаблона сканирования EOD:

1. Установить шкалу отклонения EOD на начальное значение. Удостоверьтесь, что нет вызванного усилением ограничения напряжения усиления усилителя мощности.

2. Задайте 4-точечный квадратный шаблон сканирования и измерьте расстояние до них на различных заранее заданных расстояниях с помощью камеры. Камера также должна быть откалибрована, чтобы сделать вывод о расстояниях по пиксельному расстоянию.

3. Сравните установленное расстояние с измеренным расстоянием и соответствующим образом отрегулируйте шкалу отклонения EOD.Повторяйте итерацию до тех пор, пока установленное расстояние и измеренное расстояние не совпадут.

Юстировка трактов обнаружения лавинных фотодиодов (ЛФД)

Донорский и акцепторный ЛФД присоединены к одному столику перемещения микрометров x-y-z, включая фильтры, линзы, дихроичный светоделитель и точечное отверстие. Оба детектора имеют дополнительную свободу микрометрового перемещения по x и y относительно оси распространения луча.

1. Поместите автофлуоресцентное пластиковое предметное стекло (номер детали: 92001, Chroma) на объектив микроскопа для выравнивания после добавления иммерсионного масла.

2. Сначала выровняйте APD по прямому пути луча (акцепторный APD в нашем случае), неоднократно регулируя положения x, y, z главной ступени трансляции, правильно позиционируя точечное отверстие на пути детектирующего луча с последующей точной регулировкой x и y положение APD.

3. После максимизации скорости счета фотонов на акцепторном APD повторите то же самое для донорского APD, стараясь не смещать точечное отверстие.

4. Положение точечного отверстия по оси z, а также APD немного менее критично в нашем случае, поскольку перетяжка луча возбуждающего лазера немного расширена, а точечное отверстие больше по сравнению с конфокальной установкой.Окончательную настройку положения по оси Z APD лучше всего проводить с помощью работающего датчика FRET — того, с которым мы собираемся поэкспериментировать.

5. Наиболее важным для отношения сигнал / шум не менее 2: 1 и способности захвата является правильное осевое позиционирование микрожидкостного чипа, которое мы достигаем с помощью пьезостадиона (P-527.3CD, Physik Instrumente) удерживая пробный столик.

3. Сбор данных FRET: общая стратегия для выявления конформационных флуктуаций в Rep

10 мкл раствора, содержащего 150 пМ помеченного Rep (Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 647), были приготовлены и немедленно введены в предварительно изготовленный ABEL чип.Мы скорректировали концентрацию белка таким образом, чтобы он был достаточно разбавленным, чтобы избежать попадания нескольких молекул в сайт ловушки, при этом улавливая одну молекулу, и достаточно плотным, чтобы время ожидания между молекулами, попадающими в сайт ловушки, сократилось до 10 с. 150 пМ было достаточно, чтобы наблюдать прибл. 1-5 одновременных всплесков флуоресценции донора и акцептора одной молекулы в течение 10 секунд, как показано на рисунке 6a), что отражает присутствие одиночных свободно диффундирующих дважды меченых видов репов через конфокальный объем, когда ловушка была выключена.Условия буфера (10 мМ трицин, 10 мМ сукцинат, 1,25 мМ MgCl ₂ , 0,03 мМ KCl, 10 мМ NaCl, pH 8) были выбраны для облегчения захвата ABEL, а также обеспечения конформационной свободы между высоким и низким состояниями FRET. Все эксперименты проводились в лаборатории с контролируемой температурой при 21 ° ° C.

Рис. 6. Улавливание ABEL дважды меченых молекул Rep в растворе.

(a) В отсутствие примененной обратной связи временные кривые флуоресценции донора и акцептора показывали короткие всплески длительностью обычно несколько десятков мс над фоном.(б) При наличии обратной связи время пребывания молекулы обычно составляло полсекунды, но иногда и несколько секунд. (c) Гистограмма записанных длительностей ловушек. (d) Захват Rep показал антикорреляции между траекториями флуоресценции донора (синий) и акцептора (зеленый), что соответствует наблюдаемым колебаниям эффективности FRET (красный).

В отсутствие обратной связи одиночные молекулы Rep диффундируют через шаблон лазерного сканирования с типичным временем диффузии около 30-40 мс (рис. 6а).Однако при применении обратной связи молекулы Rep, которые диффундировали в ловушку, быстро подталкивались к центру и удерживались примерно полсекунды до фотообесцвечивания или выхода из ловушки (рис. 6b). Захват, основанный на сигнале акцепторной флуоресценции, помогает максимизировать захват активных молекул FRET вместо молекул или агрегатов только-донора. Как подчеркивалось ранее, среднее время захвата изменяется в зависимости от мощности возбуждения, демонстрируя сложное взаимодействие между диффузионным выходом из ловушки, фотообесцвечиванием или переходами в долгоживущие и не излучающие темные состояния.В этой работе мы наблюдали типичное время захвата 475 мс при 20 мкВт (рис. 6b), даже в отсутствие поглотителей кислорода. Хотя прямое сравнение непросто из-за различий во времени биомолекулярной диффузии, оно было сопоставимо с теми, которые наблюдались для захваченных меченных Alexa647 молекул дцДНК в аналогичных рабочих условиях [20]. Поскольку ловушка ABEL является активной ловушкой, вторая молекула, попадающая в сайт ловушки, приведет к побегу обеих. Мы отметили, что> 10% всех захваченных молекул Rep находились в области захвата в течение> 1 секунды (рис. 6c), и зарегистрировали в среднем около 27000 донорных и акцепторных фотонов на 1 секунду захвата.Мы извлекаем временные кривые FRET из числа фотонов донора и акцептора, полученного при обнаружении APD. Карта счета одиночных фотонов (DPC-230, Becker & Hickl) регистрирует абсолютное время появления фотонов с максимальным разрешением по времени 165 пс. Мы решили представить полученные таким образом фотонные данные с временем интегрирования 1 мс.

Типичное отношение сигнал / шум варьировалось от 2: 1 до 3: 1 во время события захвата. Временное окно измерения в 30 минут позволило нам собрать в среднем 300-500 событий захвата.Освещение было равномерным по всей области захвата (см. Рис. 4d), и, таким образом, флуктуации интенсивности излучения были исключены из-за остаточного молекулярного движения. Как видно из репрезентативных кривых, показанных на фигурах 6d) и 8a), антикорреляции между интенсивностями испускаемой донорной и акцепторной флуоресценции вызывают флуктуации кажущейся эффективности FRET E _FRET . Мы отмечаем, что каждое событие захвата заканчивается переходом к фоновой флуоресценции, что указывает либо на фотообесцвечивание, либо на диффузию захваченной молекулы из ловушки.Иногда наблюдались кратковременные всплески интенсивности, указывающие на приближение второй молекулы Rep в окрестности ловушки. Агрегаты демонстрировали отчетливо разные следы фотонов со ступенчатым фотообесцвечиванием и максимальной скоростью счета, намного превышающей таковые для событий захвата одиночной молекулы, которые оставались на постоянном уровне, как мы проиллюстрировали на рисунке 6b) на протяжении всего эксперимента с одним и тем же микрожидкостным чипом.

Рис. 7. Средние фоновые скорости донорного и акцепторного каналов.

(a) Гистограммы и аппроксимации Пуассона (сплошная пурпурная линия), связанные с фоновыми показателями Alexa Fluor 546 (донор) и (b) Alexa Fluor 647 (акцептор). (c) Репрезентативные кривые, показывающие захват мономеров Rep, содержащих только донор (Alexa Fluor 546) и минимальное просачивание в канал обнаружения акцептора (Alexa Fluor 647).

Рис. 8. Репрезентативные трассы FRET и идеализированные траектории, полученные с помощью скрытого марковского моделирования.

Репрезентативные траектории (синие) и реконструированные HMM-аппроксимации (красные).б) соответствующие гистограммы эффективности FRET.

Мы определили эффективность FRET, где N _D = N _{D, измерено} — B _D и N _{A 000 A, измерено} — B _A — αN _D . N _D и N _A представляют собой общее количество отсчетов, извлеченных из донорного и акцепторного каналов, B _D и B

6 A

являются фоном соответственно отсчетов и α — это доля утечки донорной эмиссии в акцепторный канал, как определено анализом траекторий, отображающих сигналы только донора и восстановленных через.Чтобы оценить средние фоновые скорости B _D и B _A для донорных и акцепторных каналов, мы подобрали распределение Пуассона формы к гистограмме плотности вероятности из фоновых областей, где p _o — постоянная подгонки. В наших экспериментах восстановленные значения составили B _D = 3 . 97 ± 0 . 04 (± S . Д . ) отсчетов мс ⁻¹ , B _A = 10 . 0 ± 0 . 05 отсчетов мс ⁻¹ и α = 0 . 075 (см. Рисунок 7).

Временные траектории FRET от одиночных захваченных молекул Rep регистрируют конформационные флуктуации между открытой и закрытой формами — соответствующие низкому и высокому состояниям FRET соответственно — вместе со скоростями взаимопревращений (см. Рисунок 2 для открытых и закрытых состояний конформации).Мы приспособили траектории FRET к временным траекториям, отображающие дискретные квантованные флуктуации состояния, с помощью скрытой марковской модели (HMM) [81], ценного высокопроизводительного аналитического подхода для генерации объективного соответствия большим объемам данных FRET. Модель HMM представляет собой признанный метод восстановления скрытой в остальном идеализированной траектории и широко применяется в сообществе отдельных молекул для выявления взаимодействий белок-нуклеиновая кислота [82], анализа траекторий фотообесцвечивания нескольких хромофоров [83] и различения между ними. состояния одиночной молекулы FRET.Вкратце, модель использует алгоритм Витерби для извлечения наиболее вероятной последовательности состояний для данного набора данных.

В этом приложении траектории FRET моделировались с помощью алгоритма HaMMY [81] с использованием максимум 10 различных предполагаемых состояний FRET. Основываясь на сходимости критерия согласия, мы находим, что Rep принимает по крайней мере четыре быстро взаимопревращающихся конформационных состояния в тестируемых условиях. Мы применили этот метод ко всем экспериментальным траекториям FRET, извлекая истинное число состояний.Репрезентативные траектории и реконструированные HMM-аппроксимации показаны на рисунке 8.

Хотя основным преимуществом метода FRET, применяемого к репутации, является сообщение о быстрых конформационных флуктуациях и кинетике переходов с помощью скрытого марковского моделирования, важно отметить некоторые ограничения. техники в этом случае. Во-первых, нетривиальное ковалентное мечение реп-структуры соответствующими донорными и акцепторными флуорофорами является важным требованием, поскольку внутренне флуоресцентные аминокислоты в структуре, включая, например, триптофан, не обладают достаточной эмиссией или фотостабильностью для обнаружения одиночных молекул.Таким образом, необходимо следить за тем, чтобы активность rep сохранялась, независимо от положения метки или выбора флуорофоров. Во-вторых, метод маркировки является стохастическим, что означает, что при текущих настройках любая репутация, не имеющая молекулы-донора, остается незамеченной, тогда как если реп не имеет акцептора, регистрируется нулевая популяция FRET. В-третьих, измерение абсолютного расстояния затруднено из-за зависимости от вероятных колебаний в местной среде и ориентации флуорофоров. Тем не менее, данные, полученные с помощью ABEL-FRET, указывают на субдомен 2B репликации по крайней мере четырех конформационных состояний в отличие от двух, идентифицированных с помощью рентгеновской кристаллографии (рис. 2), и открывают захватывающие перспективы для выявления кинетических механизмов, лежащих в основе активности геликазы .

4. Выводы и перспективы

Ловушка ABEL характеризует зависящие от времени изменения в отдельных захваченных молекулах в течение продолжительных периодов времени без необходимости функционализации поверхности для иммобилизации молекул. Методы флуктуации, такие как FCS, которые обеспечивают доступ только к нескольким миллисекундам, необходимым для диффузии молекулы через конфокальный объем, не могут разрешить молекулярные процессы, если они не происходят во времени, превышающем время диффузии.

Обычные установки для получения изображений с широким полем зрения, такие как TIRF с временным разрешением обычно 10-50 мс, борются за доступ к короткоживущим переходам и полагаются на прикрепление белков к поверхности.Таким образом, ловушка ABEL открывает возможность для наблюдения ключевых молекулярных переходов, которые в противном случае могут быть скрыты. Его способность одновременно измерять интенсивность и эффективность FRET также позволяет идентифицировать агрегаты и виды, которые необходимо различать на основе сообщаемых уровней FRET. Это важно для однозначного выявления скрытой неоднородности в образцах.

Мы ожидаем, что этот молекулярный анализ на основе ловушек ABEL будет широко полезен в контексте исследования многих различных типов молекулярных машин в присутствии их физиологических кофакторов, а также изучения множества динамических молекулярных взаимодействий, как конформационные изменения внутримолекулярно и межмолекулярно.

5. Благодарности

Мы благодарим Михаэля Бёрша, Universitätsklinikum Jena, за его поддержку в предоставлении неограниченного доступа к аппаратуре ловушек ABEL в его лаборатории. Мы признательны за поддержку Группе по физике жизни Йоркского университета, Великобритания, BBSRC (BB / P000746 / 1, BB / R001235 / 1), Leverhulme Trust (RPG-2017-340) и Alzheimer’s Research UK (ARUK- РФ2019А-001).

Какое иммерсионное масло использовать — Cellular Imaging

Иммерсионное масло двух типов (F и N)

Тип F	Тип N
Используется для флуоресцентной визуализации при 22 ° C	Используется для фазоконтрастной визуализации, Флуоресцентная визуализация при 37 ° C
Не автофлуоресцентный.Хорошо работает только при комнатной температуре (22 ° C).	Немного автофлуоресцентный. Также работает при 37 ° C (инкубатор)
Confocal SP8-X Widefield DMR (стойки)	Конфокальный SP8-X-SMD (37 ° C) Микроскопы с живыми клетками (37 ° C)

Используйте масло N-типа только для экспериментов по фазовому контрасту и / или флуоресценции при 37 ° C

Как использовать иммерсионное масло

Для нанесения иммерсионного масла:

1. Отодвиньте линзу от слайда
2. Нанесите каплю масла на слайд (не используйте слишком много, но и не слишком мало)
3. Осторожно опустите линзу, пока она не коснется масла
4. Найдите фокус вашего образца
5. Если вы видите пузырьки воздуха, удалите масло как с линзы, так и с предметного стекла и начните с

Иммерсионное масло следует очистить с поверхностей линз и предметных стекол после завершения наблюдений.Делайте это для каждого нового слайда. Масло, оставшееся на поверхности линз, со временем высохнет, и его будет очень трудно удалить.

1. Осторожно сотрите масло со всех стеклянных поверхностей сложенной тканью.
2. Второй салфеткой, смоченной в небольшом количестве спирта из флакона для духов, протрите стеклянные поверхности, чтобы удалить любые полосы остатков масла.

Дополнительная информация об иммерсионном масле, числовой апертуре и рабочем расстоянии

Качество и разрешение вашего изображения в основном зависит от числовой апертуры (NA) используемого объектива.Вкратце, числовая апертура относится к свойствам сбора света оптическими компонентами вашего микроскопа. Использование иммерсионного объектива и масла может улучшить как разрешение, так и числовую апертуру.

Точные физические свойства среды / материала, через который проходит свет, определяют величину дифракции света. Он известен как «показатель преломления» и выражается без единиц измерения, как и NA. В непогружных (или «сухих») объективах существует воздушный зазор между передней линзой объектива и верхней поверхностью покровного стекла. Большинство покровных стекол микроскопов имеют коэффициент преломления 1,5, в то время как воздух имеет коэффициент преломления 1,0. И, как вы знаете, когда свет переходит от одной среды к другой, скажем от стекла к воздуху, он «преломляется» или изгибается и рассеивается. Следовательно, если вы используете сухой объектив, световые лучи от вашего образца будут преломляться при выходе из покровного стекла в воздух. Преломленные лучи обычно не собираются передней линзой объектива и теряются в окончательном изображении.

Теперь, если вы используете иммерсионное масло для замены воздушного зазора, вы можете исправить это несоответствие.Иммерсионные масла имеют показатель преломления около 1,51 — аналогично стеклу. Это улучшает качество и разрешение вашего мощного иммерсионного объектива и увеличивает числовую апертуру за счет снижения рефракции.

Когда вы фокусируете объектив и приближаете его к предметному стеклу / покровному стеклу, фокальная плоскость перемещается дальше в ваш образец. Однако существует физическое ограничение на то, как далеко вы можете зайти, прежде чем кончик носа объектива коснется покровного стекла. Пройдите дальше этого расстояния, и у вас будет большая проблема ! Очистка конденсатора от осколков стекла — дело трудоемкое и дорогостоящее.Не говоря уже о том, что вы можете повредить переднюю линзу объектива.

Когда образец находится в резком фокусе, фактическое расстояние (в миллиметрах или микронах) между передней линзой объектива и поверхностью покровного стекла называется «рабочим расстоянием». Обычно существует обратная зависимость между увеличением и рабочим расстоянием. Объектив с увеличением 10X имеет приблизительное рабочее расстояние 4 мм, тогда как масляный иммерсионный объектив 100X имеет рабочее расстояние примерно 130 мкм .

Друг или враг? Понимание значения частиц в анализе масла

В области трибологии слово «частицы» означает для разных людей разные вещи. Следующие тематические исследования показывают, как по-разному инженер-механик, триболог, пробоотборник, аналитик и диагност интерпретируют присутствие частиц.

Для инженера-механика и триболога присутствие частиц является признаком того, что в систему попали загрязнения или что некоторые компоненты изнашиваются ненормально.Частицы, размер которых меньше минимального, могут привести к абразивному износу, который, в свою очередь, приведет к преждевременному старению или выходу из строя. Крупные частицы могут привести к закупорке масляных каналов, что может привести к масляному голоданию. Таким образом, оба условия создают проблемы для этих ролевых игроков.

На этом рисунке показано, как частицы вызывают повреждения
контактирующим частям. (См. Очиститель масла Triple-R)

Пробоотборник

Основная задача пробоотборника — получение однородной пробы, которая является репрезентативной для общего объема масла в системе.Присутствие частиц усложняет задачу пробоотборника, поскольку частицы имеют тенденцию оседать на дне резервуара / отстойника.

Перед отбором проб масло должно быть горячим и хорошо взболтать, чтобы проба содержала осевшие частицы. При обычном анализе масла контейнер не должен быть заполнен более чем на 80 процентов, чтобы лаборатория могла взболтать образец перед анализом.

Неправильное обращение с пробами включает переполнение контейнеров, декантирование проб, которые были изначально заполнены до верха, и отбор проб, когда масло не циркулировало в достаточной степени до отбора проб.Переполнение емкости приводит к недостаточному перемешиванию. Встряхивание контейнера перед декантированием приведет к тому, что на дне контейнера останутся крупные частицы. Также существует вероятность того, что менее загрязненная часть будет декантирована, в результате чего лабораторный результат будет выше, чем обычно.

Аналитик

Как только образцы попадают в лабораторию, присутствие частиц определяет задачи и методы, которые химический аналитик будет использовать для анализа образцов.Метод подготовки проб, аналитические методы и приборы, необходимые для обеспечения репрезентативности результатов для условий, существующих в приложении, зависят от типа, размера, свойств и распределения частиц, присутствующих в пробах.

Различные аналитические методы, включая спектрометры с индуктивно связанной плазмой (ICP), проточную ячейку инфракрасных спектрометров с преобразованием Фурье (FTIR) и некоторые счетчики частиц, используют перистальтические насосы и транспортные системы (трубки) для ввода образцов в различные инструменты.Если в образцах присутствуют крупные частицы, существует вероятность того, что трубка может быть заблокирована.

68%	посетителей сайта machinerylubrication.com считают наличие твердых частиц ценным показателем в пробе для анализа масла

Аналитики также должны знать о склонности частиц оседать на дне контейнера. Перед каждым анализом образцы следует достаточно взболтать, чтобы обеспечить гомогенное состояние.Снижение вязкости жидкости либо из-за разбавления топлива в двигателе, либо из-за разбавления из-за аналитических требований (например, ICP) усиливает тенденцию к осаждению частиц. При анализе ICP образцы необходимо разбавить, чтобы облегчить процесс транспортировки. Из-за разбавления взвешенные частицы более склонны оседать на дне пробирки и не будут доступны для анализа. Однако при анализе с вращающимся дисковым электродом (RDE) разбавление не требуется.

Диагност

Частицы могут быть полезны для диагноста, изучающего форму и природу частиц, обнаруженных в образце.Сканирующий электронный микроскоп (SEM) может помочь в исследовании первопричины механического отказа, позволяя диагносту уделять особое внимание свидетельствам, таким как царапины на частицах и способам образования частиц.

Тонкая фильтрация — это упреждающий процесс, направленный на удаление загрязнений и частиц износа из системы. Если этот процесс не выполняется с особой тщательностью, знаниями и вниманием к той ценности, которую частицы добавляют для диагноста при анализе первопричин, важные доказательства могут быть потеряны.

Пример # 1: RDE против спектрометрии ICP

В 2002 году лаборатория Eskom перешла с ИСП на спектрометрию RDE, чтобы проводить анализ металлов износа отработанных масел. Для получения новой базовой линии необходимо было применить оба спектрометрических метода, а также количественный анализ частиц железа (PQ) для всех образцов, полученных в течение трехмесячного периода.

Когда спектрометрические результаты были нанесены на график относительно значений PQ, было определено, что чем выше было значение PQ для образца, тем больше разница между результатами ICP и RDE.Для значения PQ 15 миллиграммов железа на литр (мг / л Fe) ожидаемая разница между двумя методами составляла примерно от 0 до 5 частей на миллион. Однако выше значения PQ, равного примерно 75 мг / л Fe, зависимость, казалось, стала нелинейной, где различия между результатами ICP и RDE составляли от 50 до более чем 500 ppm.

На этом графике показана взаимосвязь между RDE и ICP относительно PQ
. как определено на выборках из разных источников.

Один образец со значением PQ 1712 мг / л Fe имел значение железа 699 ​​частей на миллион по данным ICP.Результат RDE для этого же образца оказался в районе 3000 ppm. Разница в результатах, полученных двумя спектрометрическими методами, составила 2300 ppm.

Когда были изучены тенденции износа устройства со значением PQ 1,712 мг / л Fe, результаты ICP создали впечатление, что проблема либо решена, либо стабилизирована. Однако когда стали доступны результаты RDE, стало очевидно, что износ увеличился. В заключительном отчете рекомендуется остановить установку для аварийного обслуживания.

Из-за более низкого ограничения размера частиц для ICP плато было достигнуто гораздо раньше, чем для RDE. Ограничения ICP по размеру больше всего пострадали от приложений, в которых не было внутренних систем фильтрации масла, таких как редукторы и некоторые компрессоры.

Геометрия частиц, анализируемых RDE, также повлияла на результаты. Например, если в образце присутствовали тонкие чешуйки металла, то показания хлопьев, расплющенных на RDE, отличаются от показаний частиц, которые не расплющились.Таким образом, результаты RDE варьировались из-за размера частиц, а также их геометрии.

Пример # 2: Сильные царапины в локомотивном двигателе

Двигатель одного локомотива был заменен на недавно отремонтированный двигатель. Когда двигатель был установлен, бригада технического обслуживания столкнулась с трудностями при устранении аномальной вибрации в двигателе. В конце концов было установлено, что вибрацию вызывает изогнутый маховик.

Как только проблема с вибрацией была устранена, стали слышны царапающие звуки.Все было проверено, но источник шума установить не удалось. Инженер по обслуживанию решил привлечь к исследованию лабораторию, которая выполнила программу мониторинга нефти.

Поскольку двигатель был недавно отремонтирован и первоисточник был неизвестен, у лаборатории не было истории, на которой можно было бы поставить диагноз. Чтобы получить больше информации о твердом содержании образца масла, лаборатория использовала специальные методы, такие как электронно-дифракционное рентгеновское сканирование (EDX) с использованием SEM.

Чтобы выяснить, вызван ли шум недостаточной смазкой, лаборатория определила вязкость масла. Это должно было установить, не произошел ли контакт металл-металл в результате слишком жидкого масла. Новый образец масла указанной смазки был представлен для сравнения с образцом масла, взятым из двигателя.

Затем был проведен PQ-анализ для определения магнитных свойств масла с последующим спектрометрическим элементным анализом с использованием спектрометрии RDE.EDX-сканирование с использованием SEM было выполнено на частицах, уловленных после того, как образец был профильтрован через мембрану фильтра 0,8 микрон и промыт пентаном для удаления остатков масла.

Результаты показали, что вязкость была приемлемой по сравнению с вязкостью эталонного образца, в то время как значения PQ были очень высокими (более 1000 мг / л Fe). Спектрометрический анализ RDE показал увеличение содержания меди, железа и цинка по сравнению с контрольным образцом.

EDX-сканирование с использованием SEM обнаружило следующие компоненты на фильтре:

• Высокое содержание белого металлического несущего материала
• Лады металлические
• Стружка железная, свинцовая и медная с царапинами
• Металлическая стружка со свинцом на ней
• Частицы цинка не в сочетании с медью
• Минерал / камень / почва, содержащая фосфат кальция
• и силикат кальция
• Силикат кремния и алюминия
• Кусочек силикона

Частицы как враги

Особые доказательства, такие как царапины на металлических ладах, свидетельствовали о том, что неровные предметы (частицы) были причиной ненормального износа гильзы и / или коленчатого вала.Обнаруженный кусок силикона свидетельствует о чрезмерном использовании силиконсодержащего вещества, такого как герметик, который, возможно, выдавливался между частями, затвердевал и отрывался горячим текущим маслом. Эти силиконовые детали могли заблокировать масляные каналы, что привело к опасной ситуации масляного голодания.

Частицы, включая кремний (кварц) и песок (силикат алюминия), а также другие частицы, обнаруженные в образце масла, были причиной аномально высокого износа. Поскольку абразивный износ был основной причиной преждевременного старения и приводил к серьезным повреждениям деталей, контактирующих с этими объектами, инженер по техническому обслуживанию хотел выяснить причину первоначального попадания этих частиц в систему.

Для пробоотборника было важно убедиться, что в отобранной пробе было собрано как можно больше доказательств. В этом случае, когда окончательный отказ был бы катастрофическим, задача могла быть довольно сложной, так как все частицы осели на дно при охлаждении масла. Таким образом, типичный образец, взятый обычным способом, может не позволить собрать все доказательства.

Частицы как друзья

Открыв сокровище улик, которое было заключено в частицах, обнаруженных в масле, диагност получил информацию об образовании таких частиц.Наличие металлической стружки указывало на возможное несоосность. Также было обнаружено отсутствие смазки, что, возможно, было связано с закупоркой масляных каналов из-за присутствия посторонних частиц. Металлическая железная стружка с привязанным к ней свинцом предполагала сварку из-за масляного голодания (контакт металла с металлом).

Обнаружение частицы с царапинами привело к исследованию объектов, которые могли быть причиной повреждений. Один возможный виновник был обнаружен в частице, состоящей из фосфата кальция и силиката кальция.Этот конкретный минерал (возможно, апатит) вместе с частицами, содержащими кварц и песок, позволил сделать вывод, что двигатель произошел от локомотива, который попал в аварию с последующим сходом с рельсов, когда в двигатель попала почва. Очевидно, при ремонте двигателя почва не удалась.

В образце масла обнаружены железная стружка с царапинами (вверху) и грязь (вверху).

Пример # 3: Отказ подшипника пальца кисти на тепловозе

До выхода из строя подшипника пальца кисти пробы масла с тепловоза были отправлены в две разные лаборатории для стандартного анализа масла.Первая лаборатория выпустила предупреждения о возможном износе подшипников пальца кисти за четыре недели до отказа, в то время как вторая лаборатория указала, что аномального износа не было. Была взята повторная проба, и снова вторая лаборатория не обнаружила аномального износа, в то время как первая лаборатория выдала еще одно предупреждение об износе.

Владелец автопарка решил остановить локомотив, чтобы выяснить, оправданы ли предупреждения первой лаборатории. Было обнаружено, что опора пальца кисти вышла из строя, в результате чего были повреждены четыре силовых агрегата.Было начато расследование, чтобы определить основную причину, по которой в двух лабораториях были поставлены разные диагнозы.

Были проведены стандартные контрольные испытания масла, включая спектрометрический анализ с использованием спектрометрии RDE и PQ. EDX-анализ с использованием SEM на обломках фильтра был проведен после того, как образец был профильтрован через мембрану фильтра 0,8 микрон и промыт пентаном для удаления остатков масла. Результаты спектрометрического анализа RDE показали увеличение содержания серебра, меди и железа, в то время как анализ SEM подтвердил присутствие частиц размером более 10 микрон.

Поскольку обе лаборатории выполняли аналогичный анализ на регулярной основе, исследование было сосредоточено на различиях в методах, используемых двумя лабораториями. Единственное существенное различие заключалось в том, что лаборатории использовали разные спектрометрические методы для определения содержания металла износа в образцах, а именно спектрометрию ICP и RDE.

Эти изображения локомотивного двигателя
выявить неисправность подшипника пальца кисти.

Основное различие между двумя методами — способ ввода образца в систему. Для анализа ICP образец разбавляется перед введением в прибор. Следовательно, возможно, что частицы осели до анализа. ICP также использует перистальтический насос и транспортную систему, которая может быть заблокирована.

Кроме того, ограничение размера ICP составляет от 1 до 3 микрон, а диапазон RDE — от 8 до 10 микрон.СЭМ-анализ подтвердил присутствие частиц размером более 5 микрон, поэтому, похоже, неисправность вышла за пределы того уровня, когда ICP могла обнаружить частицы износа, но оставалась в пределах диапазона RDE.

Пример # 4: Износ гильзы и поршня тепловоза с дефектами

В рамках программы анализа масла масло в картере локомотива проверялось ежемесячно. Однако за период с января по конец июня проб не поступило.Двигатель вышел из строя в конце сентября.

Причина для беспокойства заключалась в том, что все лабораторные отчеты вернулись без каких-либо указаний на увеличение содержания металла износа. Было начато расследование, чтобы объяснить, почему лабораторные испытания не выявили какого-либо увеличения износа, когда было очевидно, что аномальный износ произошел из-за произошедшего механического отказа.

Поскольку никаких отклонений от нормы не было обнаружено, за исключением разбавления топлива в течение длительного периода, исследование было сосредоточено на интервалах отбора проб и методах, которые могли повлиять на результаты.

Были выполнены стандартные тесты по мониторингу масла, включая спектрометрический анализ с использованием спектрометрии RDE, а также EDX-анализ с использованием SEM на обломках фильтра после того, как образец был отфильтрован через мембрану фильтра 0,8 микрон и промыт пентаном для удаления остатков масла.

Результаты показали сильное разбавление топлива. Спектрометрия RDE не показала увеличения содержания металлов с момента анализа предыдущего образца. EDX-анализ показал, что на фильтре присутствовали изолированные крупные частицы (более 20 микрон) тяжелых металлов и других неорганических оксидов.Многие из более крупных частиц представляли собой железо или оксиды железа. Мелкие частицы состояли в основном из сульфата кальция.

На этих фотографиях локомотивного двигателя видны сильные зазубрины гильзы и износ поршня.

Снижение вязкости жидкости, которое могло произойти из-за разбавления топлива в двигателе, усилило тенденцию к осаждению частиц. Следовательно, возможно, что взвешенные частицы осели на дно отстойника и не вошли в пробу.

На более ранних стадиях отказа образовывались более мелкие частицы (вероятно, в период, когда образцы не были представлены). По мере развития разрушения размер частиц увеличивался. Поскольку были обнаружены частицы размером более 10 микрон, возможно, что неисправность вышла за пределы точки, в которой RDE смог бы обнаружить частицы износа. Таким образом, сильное разбавление топлива в течение длительного периода времени в сочетании с непредставлением проб масла на начальных этапах отказа привело к невозможности обнаружения отказа с помощью стандартной программы анализа масла.

Частица размером более 20 микрон
был обнаружен в пробе масла.

В заключение, очевидно, что удаление частиц из системы перед отбором проб посредством неизбирательной фильтрации, неправильного обращения с пробами и осаждения частиц может привести к потере важных доказательств, которые могут привести к раннему обнаружению возможных отказов или помочь в анализ причин.

Помните, что цель анализа масла — избежать поломки до того, как она случится.Чувствительность в отношении размеров частиц и ограничений по размеру аналитических методов относительно интервалов отбора проб имеет жизненно важное значение для достижения этой конечной цели. В конце концов, успех программы анализа масла для обнаружения возможных режимов отказа зависит от способности инженера-механика, триболога, пробоотборника, аналитика и диагноста лечить и реагировать на присутствие частиц соответствующим образом.

% PDF-1.5 % 198 0 объект> эндобдж xref 198 88 0000000016 00000 н. 0000003250 00000 н. 0000003367 00000 н. 0000003402 00000 п. 0000004044 00000 н. 0000004178 00000 п. 0000004312 00000 н. 0000004471 00000 н. 0000004891 00000 н. 0000005110 00000 н. 0000005605 00000 н. 0000006036 00000 н. 0000006395 00000 н. 0000006770 00000 н. 0000006979 00000 п. 0000007502 00000 н. 0000008087 00000 н. 0000008406 00000 п. 0000008878 00000 н. 0000009256 00000 н. 0000009415 00000 н. 0000009503 00000 н. 0000010193 00000 п. 0000012001 00000 п. 0000014137 00000 п. 0000014425 00000 п. 0000014705 00000 п. 0000015083 00000 п. 0000015698 00000 п. 0000016189 00000 п. 0000016415 00000 п. 0000018386 00000 п. 0000018442 00000 п. 0000020473 00000 п. 0000020989 00000 п. 0000021325 00000 п. 0000021382 00000 п. 0000021622 00000 н. 0000022245 00000 п. 0000022517 00000 п. 0000022762 00000 п. 0000023179 00000 п. 0000023364 00000 п. 0000023613 00000 п. 0000023804 00000 п. 0000024219 00000 п. 0000025690 00000 п. 0000025881 00000 п. 0000025966 00000 п. 0000026276 00000 п. 0000026512 00000 п. 0000026841 00000 п. 0000028395 00000 п. 0000028652 00000 п. 0000028913 00000 п. 0000029100 00000 н. 0000029293 00000 п. 0000030342 00000 п. 0000031390 00000 н. 0000031473 00000 п. 0000033328 00000 п. 0000033470 00000 п. 0000033617 00000 п. 0000035491 00000 п. 0000036942 00000 п. 0000039732 00000 п. 0000053970 00000 п. 0000068028 00000 п. 0000074057 00000 п. 0000075054 00000 п. 0000075761 00000 п. 0000076359 00000 п. 0000080260 00000 п. 0000084063 00000 п. 0000087504 00000 п. 0000092581 00000 п. 0000093629 00000 п. 0000095518 00000 п. 0000096352 00000 п. 0000099093 00000 п. 0000101693 00000 н. 0000183828 00000 н. 0000184376 00000 н. 0000184602 00000 н. 0000226752 00000 н. 0000226790 00000 н. 0000239029 00000 н. 0000002056 00000 н. трейлер ] >> startxref 0 %% EOF 285 0 obj> поток x ڤ TKlU3 = vI & 1 &] 8N «NOIO> LEZ% @ BM7H0RKAbɆ ! P6PgĆ #} {} o

Дорожная карта методов корреляционной микроскопии на 2018 год

Сведения об авторах

¹ Nano Life Science Institute (WPI-NanoLSI), Канадзавский университет, Канадзава, Япония

² Department of Life Sciences & Химия, Университет Якобса, Бремен, Германия

³ Ionovation GmbH, Оснабрюк, Германия

⁴ MRC Подразделение иммунологии человека, Институт молекулярной медицины Weatherall, Оксфордский университет, Хедли-Уэй, OX3 9DS Оксфорд, Великобритания

⁵ Институт Фрэнсиса Крика, Лондон, Соединенное Королевство

⁶ INM — Институт новых материалов Лейбница, 66123 Саарбрюккен, Германия

⁷ Саарландский университет, 66123 Саарбрюккен, Германия

⁸ Dpto 8 Dpto.Física de la Materia Condensada Universidad Autónoma de Madrid 28049, Мадрид, Испания

⁹ Instituto de Física de la Materia Condensada IFIMAC, Автономный университет Мадрида 28049, Мадрид, Испания

¹⁰ KU Leuven, -3001 Хеверли, Бельгия

¹¹ Институт прикладной оптики, Университет Фридриха-Шиллера, Йена, Германия

¹² Институт фотонных технологий Лейбница (IPHT), Йена, Германия

¹³ Кафедра машиностроения, Университет Висконсин-Мэдисон, 1513 University Ave, Madison, WI 53706, Соединенные Штаты Америки

¹⁴ Институт ревматологии Кеннеди, Оксфордский университет, Оксфорд, Соединенное Королевство

¹⁵ Институт Дебая, Утрехтский университет, Утрехт, Нидерланды

¹⁶ Департамент клеточной биологии, Университет Гронингена, Университетский медицинский центр Гронингена, Гронинген , Нидерланды

¹⁷ Отдел структурной биологии, Wellcome Trust Center for Human Genetics, Оксфордский университет, Оксфорд, Великобритания

¹⁸ Центр структурной системной биологии Гамбург и Гамбургский университет, Гамбург, Германия

¹⁹ Институт Генриха Петте, Институт вирусологии Лейбница, Гамбург, Германия

²⁰ Физика визуализации, Технологический университет Делфта, Делфт, Нидерланды

²¹ Департамент биохимии, Оксфордский университет, Оксфорд, Великобритания

²² Секция клеточной биологии, Центр молекулярной медицины, Университетский медицинский центр Утрехта, Утрехтский университет, Heidelberglaan 100, 3584CX Утрехт, Нидерланды

²³ Центр расширенной визуализации, Университет Квинсленда, Брисбен, QLD 40724, Австралия

²⁴ Университетская клиника Йены, Йена, Германия

²⁵ Факультет наук, Саарский университет, 66421 Хомбург, Германия

²⁶ Геттингенский университет, Третий институт физики и биофизики, 37077 Геттинген, Германия

²⁷ KU Leuven, Департамент инженерной биологии, B-3001 Heverlee, Бельгия

²⁸ Геттингенский университет, Институт рентгеновской физики, 37077 Геттинген, Германия

²⁹ SmarAct GmbH, Schütte-Lanz-Str.